Cours 8 - Cycle cellulaire

Question 1

Quelles sont les 5 phases du cycle cellulaire?

Answer 1

• G1 : Gap
• S : Synthèse
• G2 : GAP
• M : mitose
• G0 : dormance

Question 2

En quoi est-ce avantageux d’utiliser la levure pour étudier le cycle cellulaire? Aussi, décrire un protocole pour étudier les gènes importants dans le cycle cellulaire.

Answer 2

Les mutations dans des gènes cdc (cell-division-cyle) peuvent être thermosensibles. Les mutations dans le cycle cellulaire sont d’habitude létales.

L’incubation à différentes températures permet de faire des mutants thermosensibles.

Protocole : dupliquas de levures mutantes et incuber à différentes températures. Une température est permissive et l’autre enlève la fonction de la protéine - si la protéine est essentielle pour la division, arrêt des cellules toutes au même endroit dans le cycle cellulaire!

• Étude sur le fonctionnement de la protéine ET permet l’étude de ce qui se passe dans certaines phases du cycle cellulaire.

Question 3

Pourquoi est-ce que les ovocytes de xenopus sont utilisés pour étudier le cycle cellulaire?

Answer 3

Ils contiennent tout ce qui faut pour de multiples divisions cellulaires et on peut muter des gènes d’intérêt. Ils ont une grande quantité de cytoplasme et l’ADN des noyaux isolés peut être répliqué in vitro.

Question 4

Quel est l’objectif d’utilisation de la bromo-deoxyuridine (BrdU) dans l’étude des cycles cellulaires? Et comment?

Answer 4

Calcul de l’index mitotique : BrdU va incorporer l’ADN des cellules en division. Par FACS, on peut voir les cellules en division qui sont en G1 (1 copie d’ADN), et en G2 (2 copies d’ADN).

Question 5

Que peut-on utiliser pour synchroniser les cultures cellulaires pour qu’elles soient toutes dans la même phase de division?

Answer 5

Des inhibiteurs chimiques.

Question 6

Quels sont les 3 facteurs extracellulaires qui contrôlent la division et la croissance des cellules? Expliquer un peu l’effet de chacun.

Answer 6

• Facteur de croissance : stimule la croissance d’une cellule en augmentant sa masse cellulaire.
• Mitogène : stimule la division cellulaire par la stimulation d’activité G1/S-Cdk, ce qui entrave des contrôles négatifs intracellulaires qui bloquent la progression du cycle cellulaire.
• Facteur de survie : permet la survie cellulaire en inhibant l’apoptose.

Question 7

Quel est le rôle des cdks dans le cycle cellulaire? Quelle molécule est nécessaire pour leur activité? Et qu’est-ce qui donne leur spécificité?

Answer 7

Les Cdks (cyclin-dependant kinases) sont des kinases dépendantes des cyclines qui sont pas mal la base du cycle cellulaire. Les Cdks doivent être liées à la cycline pour fonctionner. La spécialité des cdk change selon la cycline avec laquelle elle est liée.

Question 8

Comment se fait la régulation des Cdks par CAK?

Answer 8

CAK = Cdk activating kinase. Après la liaison du CDK avec une cycline, CAK doit phosphoryler le complexe pour le rendre complètement actif.

Question 9

Comment se fait la régulation des Cdks par Wee1?

Answer 9

Suppression de l’activité des CDK par la phosphorylation inhibitrice par Wee1 kinase.

Question 10

Comment se fait la régulation des Cdks par les CKIs?

Answer 10

Les CKIs (cdk-inhibitory proteins) vont supprimer l’activité des complexes cycline-cdk par interaction avec des protéines inhibitrices en séquestrant ces complexes.

Question 11

L’activité de p53 est impliquée dans plusieurs points de contrôle du cycle cellulaire. Que sont les p53? Comment fonctionnent-ils?

Answer 11

P53 est un facteur de transcription qui va activer la production des CKIs, ce qui va séquestrer rapidement tous les complexes cycline-cdk et arrêter la réplication de la cellule.

Question 12

Comment se fait la régulation des Cdks par le complexe APC/C? Quelle est son activité et que vise-il? Et qu’est-ce qui peut inactiver l’APC/C?

Answer 12

APC/C (anaphase promoting complex) est un complexe E3 qui est nécessaire à l’ubiquitinylation des protéines comme les cyclines S et M pour leur destruction, ce qui inactive la majorité des cyclines dans la cellule. Les G1/S-cdk vont inactiver APC/C.

Question 13

Quel est le lien de l’APC/C avec le cdc20?

Answer 13

APC/C est un complexe E3 qui utilise Cdc20 pour choisir ses cibles durant l’anaphase - il va cibler les protéines à dégrader.

Question 14

À quoi sert le complexe SCF? Décrire son activité et son rôle dans le cycle cellulaire.

Answer 14

C’est un complexe E3 qui a une activité constitutive. Le complexe cible uniquement les protéines phosphorylées pour la dégradation.

Puisque le cycle cellulaire est régulé par des kinases, les cdk peuvent cibler certaines protéines pour être dégradées.

Question 15

Nommer les 3 protéines kinase et phosphatases qui modifient les cdk et le rôle de chacun.

Answer 15

• CAK : phosphorylent des sites actifs dans les cdks.
• Wee1 : phosphorylation inhibitrice des cdks.
• Cdc25 : enlève les phosphates inhibiteurs des cdks.

Question 16

Nommer les 4 ubiquitine ligases et leurs activateurs et les décrire brièvement.

Answer 16

• APC/C : catalyse l’ubiquitinylation des protéines régulatrices.
• Cdc20 : Active l’APC/C et choisit les protéines à dégrader.
• Cdh1 : maintient l’activité de l’APC/C après l’anaphase et durant la phase G1.
• SCF : catalyse l’ubiquitinylation des protéines régulatrices impliquées dans G1.

Question 17

Les mitogènes stimulent la mitose via l’activation d’une GTPase. Laquelle? Décrire la chaîne de signalisation qui suit l’activation de cette GTPase jusqu’à la transcription des gènes codant pour les cyclines G1/S et S.

Answer 17

Stimulation de la mitose via l’activation de la GTPase Ras, ce qui active MAPK qui stimule la transcription du gène Myc. Myc stimule la transcription des G1 cyclines et la G1-CDK va phosphoryler la protéine Rb qui va libérer E2F et permettre la transcription des gènes codant pour des G1/S et S cyclines.

Question 18

Quel est le rôle du gène Myc dans le cycle cellulaire?

Answer 18

Stimule la transcription des G1 cyclines.

Question 19

Lors de la phase G1, il y a production de cycline S, mais on ne veut pas y avoir de réplication d’ADN tant que la cellule n’est pas prête. Comment se fait la régulation des cyclines S pour intervenir qu’au bon moment?

Answer 19

Les S-CDK seront inhibées par des CKIs lors de la phase G1. (Chez les animaux, p27 agit comme CKI).

p27 inhibe l’activité des complexes CDK-cycline. À un moment, on a un seuil de production de la protéine et on produit de la cycline G1S : complexe avec le CDK = kinase qui peut phosphoryler le CKI, qui peut alors être reconnu par le complexe SCF et être dégradé. Donc, complexes cycline S et CDK maintenant actifs!

Question 20

Qu’est-ce qu’est le phénomène du point de bascule? Donner un exemple.

Answer 20

Avec d’autres protéines multimériques (seulement fonctionnel en tetramère) : petite concentration de l’input = peu d’activation. Mais à une concentration qui atteint le seuil critique : activation des 4 sous-unité et BOUM. Donne une courbe d’activité qui n’est pas linéaire.

Question 21

Pourquoi est-ce que la dégradation de p26 par le SCF suit un modèle de point de bascule?

Answer 21

Parce que SCF a 5 ou 6 sites de phosphorylation difficilement atteignables, donc il faut une très grande quantité de CDK pour phosphoryler tous ses sites.

Question 22

Nommer et décrire ce qui se passe dans les 5 phases de la mitose.

Answer 22

I. Prophase

• Condensation de la chromatine
• Centrosomes repartis en deux endroits opposés du noyau
• Microtubules cytoplasmiques en réorganisation, formation du fuseau mitotique
• Désagrégation du cytosquelette
• Fragmentation du Golgi et du RE
• Dispersion de l’enveloppe nucléaire

II. Prométaphase

• Les microtubules s’attachent aux kinétochores des chromosomes
• Les chromosomes sont conduits à l’équateur du fuseau
• Les chromosomes ne sont pas encore correctement orientés

III. Métaphase

• Les chromosomes sont alignés dans la plaque métaphasique
• Chromosomes sont attachés aux deux pôles par les microtubules

IV. Anaphase

• Les centromères se détachent et les chromatides se séparent
• Les chromosomes vont vers les pôles opposés du fuseau
• Les pôles du fuseau s’écartent

V. Télophase

• Les chromosomes se rassemblent aux deux pôles du fuseau
• Les chromosomes se dispersent
• L’enveloppe nucléaire s’assemble autour des paquets de chromosomes
• Le complexe de Golgi et le RE se reforment
• Cellules filles se produisent par la cytocinèse

Question 23

Quels sont les rôles de M-Cdk dans la division cellulaire? (4)

Answer 23

• Déclenchement de la mitose
• Induit la condensation de la chromatine
• Désintégration de l’enveloppe nucléaire
• Réarrangement du golgi et du cytosquelette.

Question 24

Expliquer comment se fait le contrôle de la transition entre la phase G2 et M de la mitose. (4 étapes)

Answer 24

1. En G2, M-Cdk est phosphorylée sur une thréonine par la kinase CAK (qui l’active) et sur une tyrosine par la kinase Wee1, ce qui inhibe l’activité CDK.
2. Lors de l’entrée en phase M, la phosphatase Cdc25 est activée et élimine le phosphate inhibiteur sur la tyrosine.
3. M-Cdk activée va inhiber Wee1 et stimuler Cdc25 pour faire une rétroaction positive.
4. En fin de phase M, le phosphate activateur est enlevé, la cycline se sépare de la CDK et est ensuite dégradée par APC/C.

Question 25

Que se passe-t-il dans une cellule qui a une mutation dans Wee1? Dans Cdc25?

Answer 25

- Wee1- : les cellules se divisent de façon prématurée parce qu'il n'y a pas de phosphorylation inhibitrice. - Cdc25- : cellules vont continuer à croître sans se diviser. Surexpression dans des cas de cancer.

Question 26

Pour diviser l'ADN en 2, la cellule va souvent défaire l'enveloppe nucléaire pour la reformer après. Quelle protéine s'en charge? Comment?

Answer 26

Les M-Cdk induisent la désintégration de l'enveloppe nucléaire. Elle va le faire via la phosphorylation des lamines (filaments intermédiaires).

Question 27

Quelles sont les 3 structures qui forment le fuseau mitotique? En absence de fuseau mitotique, dans quel stade du cycle cellulaire serait prise une cellule en division?

Answer 27

- Microtubules astrales - Microtubules kinétochores - Microtubules polaires. Sans le fuseau, la cellule serait bloquée à la transition G2/M de la mitose.

Question 28

Expliquer comment se fait l'établissement du fuseau mitotique.

Answer 28

Ça commence en G1 quand le G1/S-Cdk stimule la duplication du centrosome. Au début de la mitose (prophase) certains composants du centrosome sont phosphorylés par Aurora A (action indirecte du M-Cdk), ce qui résulte en la maturation des centrosomes → association avec plus de γ-TuRC (sert à la nucléation des microtubules). En même temps, M-Cdk induit la désintégration de l’enveloppe nucléaire, ce qui donne au fuseau l’accès aux chromatides.

Question 29

L'établissement du fuseau mitotique dépend de l'action des protéines motrices (4). Les nommer et dire leur rôle.

Answer 29

- Dynéine : Attachée sur la membrane : va tirer les centrosomes vers le cortex cellulaire. - Kinésine 4,10 : chromokinésines qui marchent sur les microtubules avec comme cargaison les chromosomes vers le centre du fuseau. - Kinésine 14 : raccourcit le fuseau mitotique en fixant un microtubule et en faisant glisser l'autre. Marche vers l'extrémité (-). A comme cargaison des microtubules. - Kinésine 5 : bipolaire (marche sur 2 microtubules en même temps). Va augmenter la longueur du fuseau : importance pour pousser les centrosomes vers les pôles des cellules filles.

Question 30

Comment se fait la médiation de l'activité des dynéines vers la fin de la phase M? Et pourquoi leur action est-elle importante à ce moment?

Answer 30

Activité des dynéines plus importante dans la fin de la phase M pour ancrer les microtubules dans la membrane et tout tirer. Activation par la Cdc42, une Rho-kinase.

Question 31

Pourquoi dit-on que l'instabilité dynamique augmente durant la mitose?

Answer 31

Chez les cellules en mitose, il y a beaucoup plus de catastrophines, car il y a beaucoup de fragments de microtubules pour pouvoir ''aléatoirement'' se rendre jusqu'aux chromatides.

Question 32

Expliquer le mécanisme utilisé par la cellule pour permettre aux microtubules de trouver le kinétochore.

Answer 32

Plus de catastrophes autour des chromatides à cause de plus de stathmine inactivée. Plus qu'on approche du kinétochore, plus les microtubules peuvent polymériser.

Question 33

Expliquer comment Aurora-B est utilisée pour vérifier si les kinétochores sont tous bien liés à des microtubules.

Answer 33

Aurora-B phosphoryle le complexe de collier qui tient les microtubules - inactivation du collier quand 1 seul microtubule d'un côté. Si des 2 côtés : tension qui tire de chaque côté = tension = Aurora-B n'interagit plus avec NTC-80 = stabilisation. Empêche de tirer les 2 chromosomes dans une cellule fille.

Question 34

Expliquer comment se fait l'attachement solide des microtubules sur les kinétochores.

Answer 34

Il va y avoir un collier de site d'attachement du microtubule près du kinétochore. Il va y avoir une dépolymérisation du microtubule dans le collier pour vraiment que ce soit bien pogné là.

Question 35

Expliquer comment les Ran-GTPases peuvent augmenter la stabilité des microtubules près des kinétochores.

Answer 35

Le Ran-GEF s'associe avec les chromatides tandis que Ran-GAP est localisé partout ailleurs, ce qui fait un gradient de Ran-GTP autour des chromatides. Les importines interagissent avec les APA (aster-promoting activity) qui favorisent les astres de microtubules et les stabilise. Importines les apporte près des chromosome. Une fois rendu : compétition entre Ran-GTP et cargaison, ce qui provoque le relâchement de la cargaison.

Question 36

La transition métaphase-anaphase concorde avec quel moment clé de la mitose?

Answer 36

La séparation des chromatides sœurs.

Question 37

Les chromatides sœurs sont retenues ensemble par des protéines SMC (structural maintenance of chromosomes) comme la cohésine. Comment peut-on les séparer?

Answer 37

Avec l'activation du complexe APC/C durant la transition métaphase-anaphase, la sécurine (la fermeture du cadenas) est dégradée par ubiquitination et libère la séparase, ce qui permet une séparation facile des chromatides sœurs.

Question 38

Avant de séparer les chromatides sœurs, il faut s'assurer que tout soit prêt. Expliquer comment se fait ce checkpoint.

Answer 38

Quand il n'y a pas de microtubule attaché sur un kinétochore, Mad2 interagit indirectement avec via Mad1. Le complexe ensemble a une conformation ''open'' et une ''close''. Une des 2 conformations (open) peut inhiber le cdc20. Le Cdc20 est celui qui enclenche l'anaphase et permet le clivage des colliers sur l'ADN. Un seul Mad2 dans cette conformation peut inactiver tout le Cdc20. Quand tous les kinétochores sont liés à des microtubules, pu de Mad1, pu d'activation de Mad2, donc tout le Cdc20 peut être activé. À ce moment, on peut dégrader la sécurine et permettre la séparation des chromosomes.

Question 39

Comment est refait l'enveloppe nucléaire après la division cellulaire?

Answer 39

Après la séparation des chromosome, des extensions du RE s'associent avec chacun des chromosomes. Ces extensions se fusionnent et forment des mini-noyaux (karyomères). Puisque les cyclines sont détruites, les lamines deviennent déphosphorylées et peuvent se rassembler. Ensuite, les karyomères se fusionnent ensemble et forment le noyau.

Question 40

Lors de la cytocinèse, qu'est-ce qui forme le sillon de clivage? Quelle protéine permet de déterminer le plan de division? Comment?

Answer 40

L'anneau contractile formé d'actine et de myosine II. Le plan de division est déterminé via une interaction des microtubules du fuseau mitotique avec une protéine +TIP (kinésine). Processus : Interaction entre les microtubules et les structures d'actine. Interaction entre microtubules et rho-GTPases via une protéine +TIP = interactions avec les extrémités (+) des microtubules. Dans ce cas : des kinésines vont marcher jusqu'à l'extrémité (+) des microtubules et vont recruter un RacGAP qui inhibe l'activité de Rac (évite la formation de lamellipodes) qui recrute un Rho-GEF au centre de la cellule qui va recruter et activer Rho-Kinase qui active les formines pour faire de l'actine et de myosin like kinase pour faire l'activation de la myosine II.

Question 41

Durant la mitose, comment se déplacent les mitochondries pour avoir une répartition efficace?

Answer 41

Avec des nuages d'actine qui vont activer des comètes d'actine autour des mitochondries.