COURS N°2 - STRUCTURE PROPRIÉTÉS PROTÉINES (14.p) Flashcards
G1─ STRUCTURE PRIMAIRE DES PROTÉINES.
- A quoi correspond la structure primaire d’une prot ?
- Déterminée par quoi ?
- Les structures secondaires & tertiaires correspondent à quoi ?
◼️ La structure primaire d’une protéine correspond à la liaison des acides aminés qu’elle contient par des liaisons peptidiques.
◼️ Elle peut être déterminée par la réalisation d’un séquençage.
◼️ Les structures secondaire et tertiaire correspondent aux repliements de la protéines et la structure quaternaire est l’assemblage de sous-unités.
G1/ La liaison peptique. (x3Tab)
1➤ Définitions.
- Def : Liaoson peptidique & Peptides ?
- 3 types de polymères ?
- Structure primaire d’une prot = ?
- Comment sont appelés les AAs ici ?
Oly Poly Pro
◼️ Liaison peptidique :
- liaison covalente de type amide = CONH.
- Elle se forme par l”association de la fonction carboxylique d’un acide aminé (AA) avec la fonction amine d’un autre AA.
◼️ Peptides : polymères d’AAs liés entre eux par des liaisons peptidiques (liaisons amides) :
- Oligopeptides : - de 10 AAs => dipeptides (2 AAs), tripeptides (3 AAs)… décapeptides (10 AAs).
- Polypeptides : > 10 AAs, taille moyenne ≃ 1100 Da.
- Protéines : polypeptides de taille > 10 kDa. (dont le poids moléculaire dépasse 10 000 Da.)
◼️ Structure primaire d’une protéine = nombre d’AAs et ordre = séquence dans lequel ils sont accrochés les uns aux autres.
◼️ Dans une chaîne protéique, les AAs sont appelés résidus.
G1/ La liaison peptique. (x3Tab)
2➤ Propriétés physico-chimiques. (x3Part)
1–> La liaison peptidique est plane.
💢 SCHÉMA FORMES MÉSOMÈRES 💢
◼️ La liaison peptidique est plane :
- Les électrons des orbitales π sont délocalisée et mis en commun entre les cortèges électronique des atomes N, C et O (hybridés sp2).
- La rotation autour de la liaison C-N nécessite un fort apport d’énergie.
- Le doublet libre de N peut être mis en commun avec C, ce qui repousse les électrons de l’orbitale π sur l’O : apparition d’un N⁺ et d’un O⁻.
- Elle est donc stabilisée par résonance = délocalisation des électrons entre 2 formes mésomères.
💢 SCHÉMA FORMES MÉSOMÈRES 💢
G1/ La liaison peptique. (x3Tab)
2➤ Propriétés physico-chimiques. (x3Part)
2–>
- Les atomes Cαₙ , CONH et Cαₙ₊₁ sont immobilisés dans le même plan.
- Les liaisons peptidiques représentent des molécules de longueurs exactement identique.
◼️ Les atomes Cαₙ , CONH et Cαₙ₊₁ sont immobilisés dans le même plan :
- Ceci est dû à la délocalisation d’électrons entre ces atomes.
- Dans la nature, les conditions qui permettaient de fournir assez d’énergie pour faire tourner la liaison
peptidique ne se produisent pas. - l’immobilisation des atomes N, C, O contraint la chaîne d’AAs à adopter un nombre réduit de conformations spatiales.
◼️ Les liaisons peptidiques représentent des molécules de longueurs exactement identiques :
- La distance entre deux carbones α d’AAs qui se suivent est toujours de 3,6 angström.
- La longueur d’une chaîne peptidique est donc : nombre d’AAs x 3,6 Å.
- L’immobilisation des atomes Cαₙ, CONH et Cαₙ₊₁ dans un même plan et la constance des dimensions de la liaison peptidique déterminent la structure spatiale des protéines.
- Les dimensions de la liaison peptidique sont indépendantes de la composition en AA.
G1/ La liaison peptique. (x3Tab)
2➤ Propriétés physico-chimiques. (x3Part)
3–>
- configuration cis ou trans
- d’interactions stériques
- propriété de la liaison peptidique = flexibilité
◼️ Comme dans le cas d’une liaison double, les groupements d’atomes de part et d’autres de la liaison (sont en) peuvent adopter une configuration cis ou trans.
◼️ Par diffraction des rayons X, il a été montré que généralement, la configuration trans des atomes de Cα situés de part et d’autres de la liaison peptidique est favorisée du fait d’interactions stériques entre les chaînes latérales R de carbone α adjacents.
◼️ Cette propriété de la liaison peptidique lui permet d’avoir une certaine flexibilité en évitant que les chaînes latérales des AAs se gênent ou se repoussent.
G1/ La liaison peptique. (x3Tab)
3➤ Nomenclature.
- 1er AA..
- Dernier AA..
- sens d’écriture des protéines
- Convention d’écriture des protéines
◼️ 1er AA = NH₂ toujours libre et protonnée (NH₃⁺) à pH physiologique = extrémité amino-terminale (N-terminale).
-Les séquences peptidiques sont toujours considérées dans le sens N –> C (sens synthèse)
◼️ Dernier AA = COOH libre et déprotonnée (COO-) à pH physiologique = extrémité carboxy-terminale (C-terminale).
➯ sens d’écriture des protéines = de l’extrémité N-terminale vers l’extrémité C-terminale (= sens de synthèse). N –> C
-Convention d’écriture : H2N - Tyrosine - Alanine - Serine - COOH [ou] Tyr - Ala - Ser [ou] YAS.
◼️ Convention d’écriture des protéines :
- en écrivant les AAs en entier.
- en écrivant les AAs avec le code à 1 lettre ou à 3 lettre.
Voir forme dvlpp de Trans et Cis.
G1/ Étapes du séquençage. (x3Tab)
1➤ Définition ?
- Déterminer la structure primaire
- plusieurs chaînes polypeptidiques..
- séquençage permet..
◼️ Déterminer la structure primaire dune chaîne polypeptidique, c’est faire son séquençage. (plusieurs étapes)
◼️ Une protéine est formée d’une ou plusieurs chaînes polypeptidiques unies par des liaisons non peptidiques (ex : hémoglobine).
◼️ Le séquençage permet en outre d’étudier le lien entre la structure primaire d’une protéine et sa structure tridimensionnelle.
G1/ Étapes du séquençage. (x3Tab)
2➤ Etape 1. (x2Part)
PART 1/
- ponts disulfures doivent être réduits.
- thiols réduits / alkylation
- L’alkylation / l’iodoacétamide
💢 SCHÉMA 💢
◼️ Si la protéine comprend plus d’une chaîne peptidique, il faut les séparer :
- les ponts disulfures doivent être réduits (β-mercaptoéthanol, dithiothréitol )
- les thiols réduits (SH) sont très réactifs et doivent être protégés (stabilisés) par alkylation.
- L’alkylation est réalisée par l’iodoacétamide.
💢 SCHÉMA 💢
G1/ Étapes du séquençage. (x3Tab)
2➤ Etape 1 : Séparation et purification des chaînes polypeptidiques. (x2Part)
PART 2/
- L’iodoacétamide
- une attaque nucléophile
- liaison covalente S-C
- cystéines acétamidées
- chromatographies liquide à haute pression
◼️ L’iodoacétamide est l’amide de l’acide acétique iodé, dont l’atome d’iode (I) est très fortement électronégatif.
- L’atome C lié à l’atome I est donc déplété en électrons et réalise une attaque nucléophile des électrons du doublet libre de l’atome S de la fonction thiol portée par la cystéine.
- Il se forme alors une liaison covalente S-C, avec éjection d’un ion iodure qui capte le H⁺ libéré.
➜ production d’acide iodhyrique (HI).
✔ La chaîne peptidique porte alors des cystéines acétamidées.
✔ Les enzymes qu portent ces dérivés de la cystéine dans leur site actif ne fonctionnent plus.
◼️ Les chaînes séparées et stabilisées peuvent alors être purifiées par différentes techniques :
- chromatographies liquide à haute pression (HPLC) en phase inversée, de filtration sur gel.
- analyse des chaînes séparément.
G1/ Étapes du séquençage. (x3Tab)
3➤ Etape 2 : détermination de l’extrémité N-terminale. (x2Part)
PART 1/
- Dégradation d’Edman
- phényl thioi socy anate = liaison covalente N-C
- phényl thio carbonylé (PTC) instable
- cyclise en une phényl thio hydan toïne
💢 SCHÉMA 💢
◼️ La réaction qui permet de déterminer l’extrémité N-terminale est la dégradation d’Edman = réaction de carbamylation.
◼️ ❶ Elle utilise le phényl thioi socy anate, qui ne réagit qu’avec la fonction amine de l’AA amino-terminal ➜ formation dune liaison covalente N-C.
[formation d’un complexe phényl thio carbonylé (PTC) instable en milieu acide.]
◼️ ❷ Après un passage en milieu acide, le dérivé PTC formé devient complètement instable ➜ ❸ il se décroche et se cyclise en une phényl thio hydan toïne, dont la partie variable correspond à la chaîne latérale de l’AA N-terminal qui s’est décroché.
G1/ Étapes du séquençage. (x3Tab)
3➤ Etape 2 : détermination de l’extrémité N-terminale. (x2Part)
PART 2/
- 2ème AA => devient AA N-terminal
- nouvelle réaction chimique de dégradation d’Edman
- réaction répétée
- méthode par récurrence
- phényl thio hydan toïne , HPLC
- rendement réaction d’Edman
- 15ème réaction / 15 fois réaction
- 15 premiers AAs.
HPLC = chromatographies liquide à haute pression.
◼️ La protéine ayant été tronquée de son AA amino-terminal, l’AA qui était initialement en 2ème position devient l’AA N-terminal.
- Une nouvelle réaction chimique de dégradation d’Edman peut alors être initiée pour décrocher et identifier le 2ème AA.
- La réaction peut ainsi être répétée de façon automatisée (méthode par récurrence).
- [La méthode par récurrence : est utilisée pour séquencer l’extrémité N-term d’une protéine.
. Intérêt = Méthode automatisable, le rendement baisse à chaque étape (~15 premiers AA).] - A chaque étape une phényl thio hydan toïne est formée et identifiée par HPLC.
- Le rendement de chaque réaction d’Edman n’étant pas de 100% il n’est pas possible de distinguer le signal obtenu en HPLC du bruit de fond au delà de la 15ème réaction.
➯ La dégradation d’Edman ne peut donc être répétée qu’une quinzaine de fois.
➜ permet de déterminer les 15 premiers AAs.
G1/ Étapes du séquençage. (x3Tab)
3➤ Etape 2 : détermination de l’extrémité N-terminale. (x2Part)
PART 2/
> Dégradation d’Edman ? (suppléments d’info)
Dégradation d’Edman = cette réaction peut se reproduire plusieurs fois avec les nouveaux acides aminés N-terminaux.
G1/ La chromatographie liquide haute performance (HPLC) en phase inversée. (x2Tab)
1➤ Principe ? (x2Part)
PART 1/
- Description de la méthode ?
- Buts (x2) ?
- Permet .. ? phényl thio hydan toïnes .. selon … ?
💢 SCHÉMA 💢
◼️ C’est une méthode séparative utilisée :
> dans un but analytique : utilisation de colonnes de chromatographie de petites tailles.
> dans le but de préparer des protéines en quantité importante : utilisation de colonnes de chromatographie de tailles importantes et de fortes pressions.
◼️ Elle permet de séparer les phényl thio hydan toïnes ou les protéines selon leur coefficient de partage = affinité entre 2 phases :
G1/ La chromatographie liquide haute performance (HPLC) en phase inversée. (x2Tab)
1➤ Principe ? (x2Part)
PART 2/
- Phase stationnaire apolaire
- Phase mobile polaire hydrophile
- interactions hydrophobes
- coefficient de partage et élution.
PTC = complexe phényl thio carbonylé (instable en milieu acide)
> Phase stationnaire apolaire :
✔ résine composée de petites billes de silice sur lesquelles sont couplées des chaînes hydrogéno-carbonée (CH₂-CH₂-…-CH₃).
✔ longueur des chaînes apolaires utilisées couramment : C8 et C18.
(+ la chaîne est longue, + la résine est apolaire).
> Phase mobile polaire hydrophile : mélange de solvants organiques polaires (méthanol + acétonitrile)
> quand un mélange d’AAs est appliqué sur une colonne contenant la résine, ceux-ci se lient aux billes par des interactions hydrophobes (avec C8 ou C18).
> les acides aminés (PTC) ou les chaînes protéiques sont élués de la colonne + ou - vite selon leur coefficient de partage.
G1/ La chromatographie liquide haute performance (HPLC) en phase inversée. (x2Tab)
2➤ Interprétation des résultats ?
💢 SCHÉMA 💢
◼️ Les phényl thio hydan toïnes obtenues après chaque cycle de dégradation d’Edman sont détectées.
◼️ Chaque phényl thio hydan toïne ayant un temps de rétention spécifique, il est possible de les identifier par cette technique.
◼️ Un étalonnage de la colonne est effectué en mesurant le temps de rétention d’AAs purs dans la colonne.
- (schéma ex : sortie à 11min => Lysine) les pics résiduels sont dû à la sortie de phényl thio hydan toïnes formées aux cycles précédents.
