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MMD1045 > Diagnostic moléculaire > Flashcards

Diagnostic moléculaire Flashcards

(51 cards)

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1
Q

Définir le diagnostic moléculaire

A

Diagnostic des pathologies causées par des variations pathologiques d’un gène, de plusieurs gènes ou de l’épigénome

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Q

Quels sont les deux types de variabilité du génome ?

A
  • Variabilité non-pathologique : divergence de la séquence d’ADN n’étant pas associée à une pathologie génétique
  • Variabilité pathologique : changement permanent et transmissible de la séquence d’ADN causant un phénotype pathologique
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Q

Vrai ou faux ? Il existe peu de tests diagnostiques disponibles en génétique

A

Faux, il en existe plus de 60 000 et près de 10 nouveaux tests sont disponibles chaque jour

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Q

Combien de liens H y a-t-il entre C et G ? Entre A et T ?

A
  • C-G : 3 liens hydrogène
  • A-T : 2 liens hydrogène
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Q

Pourquoi la plupart des variations génétiques n’ont pas d’impact phénotypique ?

A
  • Surviennent dans des régions non-codantes sans affecter l’expression du gène
  • Polymorphismes fréquents (SNPs)
  • Touchent un gène récessif sans qu’il n’y ait une seconde variation dans le gène
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6
Q

Nommer des causes externes de variation génétique

A
  • Radiation
  • UV
  • Chimique (ex. agents alkylants)
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7
Q

Nommer des causes internes de variation génétique

A
  • Dépurination
  • Déamination
  • Radicaux libres
  • Erreurs de la polymérase
  • Erreurs de réplication/recombinaison
  • Méthylation
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8
Q

Pourquoi les ilôts CpG sont-ils des endroits de prédilection pour les mutations ? Décrire le mécanisme

A
  • C devient méthyl-C
  • Méthyl-C devient U
  • U devient T

Donc, CG devient TG (20x plus fréquent que les autres mutations)

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9
Q

Distinguer les types de variations non-pathologiques du génome selon leurs tailles

A
  • Grandes : CNV, LINE
  • Moyennes : microsatellites
  • Petites : SNP, indels
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10
Q

Distinguer les types de variations pathologiques du génome selon leurs tailles

A

Grands réarrangements
- Insertions
- Délétions
- Équilibrés

Petits réarrangements
- Délétions
- Insertions (mutations dynamiques)
- Substitutions (transitions, transversions)

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11
Q

Quel type de mutation pathologique est le plus fréquent ?

A

Substitution

ensuite, petites délétions et épissage

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12
Q

Nommer les 4 conséquences possibles des variations dans la séquence d’ADN

A
  • Homologue (silencieux) : change un codon pour un autre qui code pour le même acide aminé
  • Faux-sens (missense) : change un codon pour un autre qui code pour un acide aminé différent
  • Non-sens (nonsense) : change le codon pour un codon stop
  • Altération du cadre de lecture (frameshift) : insertion/délétion qui n’est pas un multiple de 3 = modification du codon et de ceux en aval
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13
Q

Vrai ou faux ? Les mutations non-sens et frameshift sont habituellement pathologiques

A

Vrai
- Les mutations homonymes sont habituellement bénignes
- Les faux-sens sont variables

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14
Q

Nommer les 5 éléments à considérer pour la pathogénicité d’une mutation

A
  • Fréquence dans la population
  • Conservation (dans la nature)
  • Impact sur l’ARNm
  • Impact sur la protéine
  • Fonction du gène
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15
Q

Distinguer gène dominant VS récessif

A
  • Dominant : phénotype exprimé à l’état hétérozygote
  • Récessif : phénotype exprimé à l’état homozygote seulement
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16
Q

Distinguer perte et gain de fonction via une mutation

A
  • Perte de fonction : réduction dans la quantité ou l’activité de la protéine entraîne le phénotype
  • Gain de fonction : augmentation dans la quantité ou l’activité de la protéine ou l’acquisition d’une nouvelle fonction entraîne le phénotype
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17
Q

Nommer les 5 mécanismes associés aux gains de fonction

A
  • Augmentation du dosage génique
  • Altération de l’expression de l’ARNm
  • Activité accrue de la protéine
  • Nouvelle fonction de la protéine
  • Altérations toxiques de la protéine
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18
Q

Vrai ou faux ? On utilise un échantillon de sang pour isoler l’ADN via les globules rouges?

A

Faux, les seules cellules nucléées du sang sont les leucocytes, c’est donc eux qu’on utilise pour isoler l’ADN

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19
Q

Décrire la technique des sels chaotropiques pour l’isolation de l’ADN ; quels sont ses avantages ?

A

ADN adsorbe sur une colonne de verre/membrane
- Non-toxique et automatisable

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20
Q

Quels sont les deux manières d’évaluer l’efficacité de l’isolation de l’ADN?

A
  • Densité optique : estimation de la quantité de l’ADN, sachant que ratio 260/280 estime la pureté (260 = absorbance max ADN, 280=absorbance max protéines)
  • Teintures intercalantes : composés qui se fixent à l’ADN double brin, permet d’estimer la quantité et la taille de l’ADN
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21
Q

En quoi consiste l’électrophorèse capillaire ?

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A

Séparation des molécules d’ADN selon leur taille en les faisant migrer à travers un gel (ex. agarose)

22
Q

Nommer un exemple de techniques de base de diagnostic moléculaire sur l’ADN génomique

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A

Buvardage Southern (Southern Blot)

23
Q

Nommer des exemples de techniques de base de diagnostic moléculaire sur produits de PCR

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A
  • PCR-migration
  • PCR-digestion
  • PCR-séquençage
  • PCR en temps réel
  • Allèle-specific oligonucleotides
  • ASPE
  • MLPA
24
Q

En quoi consiste le buvardage Southern ?

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A

Technique qui combine l’électrophorèse sur gel de l’ADN génomique fragmenté à l’hybridation par sonde complémentaire à l’ADN cible

25
Quels sont les étapes du buvardage Southern?
- Digestion de l'ADN génomique - Électrophorèse capillaire - Transfert sur membrane - Hybridation - Détection par autoradiographie
26
Vrai ou faux ? Le buvardage Southern permet de quantifier les grandes expansions (mutations dynamiques)?
Vrai
27
Quelles sont les différentes composantes de la réaction PCR?
- ADN du patient - Amorces - Polymérase - Nucléotides - Tampon (Mg, ions) - Autres additifs (si nécessaire)
28
Est-ce que la PCR est fiable à 100% ?
Non, il existe toujours un petit risque que la polymérase Taq fasse une erreur et ajoute donc un artéfact
29
Quelle formule permet de calculer le nombre de molécules d'ADN produites à chaque cycle de PCR ?
Nombre de molécules d'ADN : 2^n, où n = nombre de cycles PCR *La quantité d'ADN double à chaque cycle*
30
Qu'est-ce que la PCR-migration?
- Permet de détecter des **insertions ou délétions** - Électrophorèse capillaire des produits de PCR et détection du signal : la distance de la bande reflète sa taille
31
Quels sont des applications de la PCR-migration?
- Analyses d'identité génétique (judiciaire, contamination foeto-maternelle..) - Insertions et délétions récurrentes
32
Comment parvient-on à savoir s'il y a eu ou non contamination foeto-maternelle?
Via PCR-migration, on regarde sur l'ADN foetal si les deux allèles maternels sont présents : normalement, on devrait seulement avoir un allèle identique (l'autre vient du père)
33
Qu'est-ce que la PCR-digestion?
Digestion d'un produit de PCR par une enzyme de restriction qui reconnaît une séquence spécifique : la **mutation crée ou abolit le site de restriction**
34
Quels sont des applications de la PCR-digestion?
Mutations ponctuelles récurrentes - On doit d'abord connaître la mutation recherchée avant le test pour trouver un site de restriction crée/aboli par la mutation pour valider sa présence *Ex. on va voir une bande à 150bp et une autre à 300pb au lieu d'en voir une seule plus foncée à 150pb*
35
Qu'est-ce que la technique d'ASPE (Allele Specific Primer Extension)?
Amplification PCR, puis jeu d'amorces marquées par fluorescence dont certaines ont un mismatch 3'
36
Comment procède-t-on au séquençage Sanger ?
- Amplification PCR - Dénaturation - Réamplification avec mélange de nucléotides et nucléotides modifiés, marqués par fluorescence (incorporation aléatoire)
37
Distinguer les dNTPs et les ddNTPs
Les ddNTPs n'ont pas de -OH sur le carbone 3' du ribose, ce qui empêche la liaison du prochaine dNTP *(chain termination)*
38
Quels sont des applications du séquençage Sanger?
- Gènes avec grand nombre de mutations dispersées à-travers du gène - Méthode de choix pour substitutions - Bonne méthode pour petites insertions ou délétions *Ne permet pas de détecter les grandes anomalies de dosage*
39
Qu'est-ce que la technique de PCR temps-réel?
Réaction de PCR avec détection du produit simultanée, permet discrimination allélique et quantification (relative/absolue)
40
Comment interprète-t-on le PCR temps-réel pour la discrimination allélique?
amorce marquée avec sonde marquée - quand amorce est libérer la sonde fait une fluorescence spéficique sur l'allèle
41
Comment interprète-t-on le PCR temps-réel quantitatif ?
On fixe un seuil arbitraire, et selon le nombre de cycles auxquel on atteint le seuil, on peut trouver la quantité d'ADN de départ
42
Qu'est-ce que la technique de MLPA (Multiplex Ligation Probe Amplification)?
Méthode pour la recherche de délétions/duplications, **sonde en deux sous-unités** qui doivent s'hybrider côte-à-côte sur l'ADN du patient. La ligase scelle ensuite les 2 sous-unités, puis amplification PCR et électrophorèse capillaire
43
À quoi sert le séquençage de nouvelle génération (SNG) ?
- Permet de multiplier l'information obtenue d'une analyse - Permet d'anlyser plusieurs gènes, voire plusieurs patients en même temps grâce aux codes-barre moléculaires
44
Comment se fait la fragmentation de l'ADN dans le séquençage de nouvelle génération?
- Sonication - Nébulisation - Digestion
45
Qu'est-ce qu'un code-barre moléculaire ?
Séquence d'une quinzaine de nucléotides aléatoires qu'on lie à l'ADN d'un patient et qui permet donc de l'identifier par la suite
46
Quels sont les étapes du séquençage nouvelle génération?
- Fragmentation de l'ADN - Liaison d'adapteurs (code-barre moléculaire) - Capture - Amplification en parallèle - Séquençage en parallèle
47
Quels sont les deux techniques d'amplification en parallèle?
- PCR-émulsion : comme eau et huile, l'émulsion fait que les ADNs se séparent dans les différentes micelles - PCR-cluster : utilisation d'une plaque avec adaptateur de séquençage
48
Quel est le rôle de l'analyse bioinformatique dans le séquençage nouvelle génération?
- Procèder à l'alignement des séquences de 100/150 paires de bases générées (plusieurs milliers) - Identifier si des variations de ces séquences sont présentes - Déterminer si certaines de ces variations sont pathologiques et situées dans des gènes qui pourraient expliquer le phénotype du patient
49
Nommer deux exemples d'application du séquençage de nouvelle génération
- Exome - ADN foetal circulant (produit par l'unité placentaire, circule dans plasma de la femme enceinte)
50
Qu'est-ce qu'un exome?
C'est le 1% du génome qui contient les exons (régions codantes)
51
Vrai ou faux ? La fréquence des variations génétiques est plutôt faible dans la population?
Faux - Chaque individu à 5-6 millions de variations génétiques, dont environ 70 sont de novo - Toutefois, la plupart de ces variations n'ont pas d'impact phénotypique

MMD1045 (14 decks)

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