elektroföres och westernblot Flashcards
(36 cards)
Vad är en elektrofores?
En reparationsmetod där proteiner vandra mot anod eller katod då de placeras i ett elektriskt fält. Kan användas både kvantitativt och kvalitativt.
Vad beror vandringen av proteiner på vid en elektrofores?
Proteinets storlek, laddning, struktur, spänning.
Stort protein = mindre mobilitet.
Högre laddning = högre mobilitet.
Vandrar globulära eller fibrösa proteiner längst i en elektrofores? Varför?
Globulära vandrar längre och snabbare än fibrösa då de är kortare och mer kompakta än fibrösa proteiner som är avlånga i formen.
Vilka är de kliniska applikationerna av en elektrofores?
- Se proteinmönster i matriser som plasma/serum/likvor/urin.
- Koncentrationsbestämma proteiner.
Med mönster kan man se vart proteiner saknas eller finns i överflöd medan koncentration kan påvisa exempelvis inflammatoriska tillstånd.
Hur är en elektrofores kvantitativ?
Man färgar in proteiner för att kunna följa dem i elektroforesen. Färgintensiteten är proportionell mot mängden proteiner.
Hur många band visualiseras vid en proteinelektrofores? Vad finns i de olika banden?
5 band.
- Albumin
- Alfa 1 globuliner som HDL och alfa 1 antitrypsin.
- Alfa 2 blobuliner som alfa 2 macroglobulin och haptoglobulin)
- beta globuliner som transferrin och LDL.
- Gamma globuliner (immunoglobuliner)
Vad gör man efter en proteinelektrofores? Varför är dessa steg viktiga?
Proteiner fixeras för att de inte ska vandra ur felen.
Därefter färgas de in med färgämnen för visualisering.
kvantifiering kan sedan göras med blotting, densiteter, masspektrometri.
Vartifrån kommer proteiners laddningar?
Från aminosyrornas funktionella grupper.
Beskriv gelen som används vid elektroforeser. Vilka olika teler finns?
Gelen är edikt i vilket proteinerna vandrar. Den hindrar även en blandning mellan prov och buffert.
- Polyakrylamide
- Agarosgel
Beskriv polyakrylamide gel.
Polymerisationsprodukt av akrylamide som vid bildning bildar ett tätt nätverk av porer som minskar i storlek med högre koncentration akrylsmide.
Fördelaktigt att kunna bestämma parstorleken då mindre porer ger en bättre separation av de mindre proteinerna.
Beskriv agarosgel.
En agarosgel består av oladdade polysackarider och agar. Denna gel används generellt för en separation av större proteiner och proteinkomplex.
Byggs upp av svaga vätebindningar och hydrofon bindningar.
Vad är en SDS PAGE?
En metod där man separerar denaturerade proteiner på en polyakrylamidegel.
Hur går SDS PAGE till?
Innan elektroforsen denaturerats proteiner med SDS, DTT, glycerol.
SDS ger en denaturerad peptidkedja med negativ laddning var elektroforetiska mobilitet är omvänt proportionell mot molekylvikten.
DTT denaturerar protoner genom att bryta svavelbindningar.
Glycerol Ökar provdensiteten och gör det lättare att ladda prover till brunnar.
Bromfenolblå färgar in proteiner för att det ska kunna följas i elektroforesen.
Vad gör SDS?
Denaturerar proteiner och maskerar bindningar som kan störa vid elektroforsen.
Vilken parameter hålls normalt konstant under en elektrofores och varför?
Spänning för att undvika värmebildning.
Konstant spänning ger lägre hastighet av molekyler vid migrering och ingen värme bildas.
Vad händer om strömmen hålls konstant under en elektrofores?
Hastigheten hos molekylerna upprätthålls och värme bildas vilket kan störa elektroforesen.
Vad händer om man håller effekten konstant under en elektrofores?
Ger en lägre hastighet av molekyler men värme hålls konstant.
Vad är en southern blot?
DNA från agarosgel överförs till ett nitrocellulosa membran.
Vad är en western blot?
RNA och proteiner överförs från polyakrylamide till ett membran med hjälp av elektrisk ström.
På vilka sätt kan protein överföras från gel till membran?
Via:
kontaktdiffusion
Vacuum
elektroforetisk överföring
Hur går en elektroforetisk överföring till?
Membran och gel tillsammans med filterpapper är placerade mellan två elektroder. Proteiner migrerar till membranet via ström som genereras via spänning enligt ohm’s lag.
Resistensen är membranet, gelen, filterappret, buffert ect.
Överföringen kan påverkas av:
Bufferten - pH, viskositet, jonstyrka
Spänning
Värme
Vad är en tank blotting?
En typ av elektroforetisk överföring.
En sandwich av membran, filterpapper, gel och svamp placeras i ett buffertkärl.
Transfertiden är flera timmar.
Vad är en semi-dra blotting?
En typ av elektroforetisk överföring.
Gel och membran är sandwiched mellan filterpapper som är i direktkontakt med elektrodplattor.
I denna metod används små buffertvolymer vilket minskar körningstiden.
Vad är en transferbuffert?
Vid överföring av proteiner från gel till membran krävs en transferbuffert.
Det är fördelaktigt att använda en buffert med låg jonstyrka med pH kring 8,3. Detta då det är högre en pi för de flesta proteiner vilket innebär att proteiner då vandrar mot anoden.
Basiskt pH och SDS förbättrar eluering av proteiner från gel.
Metanol förbättrar absorptionen av proteiner till membranet.
