elektroforeza

Question 1

što je elektroforeza

Answer 1

dijagnostička metoda koja omogućava razdvajanje i vizualizaciju fragmenata DNA, njome provjeravamo što smo sve napravili s našom DNA

Question 2

nabroji neke karakteristike elektroforeze

Answer 2

migriranje nabijenih čestica u električnom polju kroz neki nosač
provodi se u odgovarajućem puferu koji služi kao elektrolit
razdvajanje molekula u električnom polju na temelju fizikalno kemijskih svojstava (naboj, veličina, struktura . . .)

Question 3

koje sve nukleinske kiseline se mogu pratiti elektroforezom

Answer 3

DNA (ds i ss), RNA, DNA/RNA-hibrid, oligonukleotidi

Question 4

prema kojem polu migriraju NK

Answer 4

prema pozitivnom polu, zbog fosfatnih skupina

Question 5

kakvi sve mogu biti nosači

Answer 5

agarozni i poliakrilamidni gel

Question 6

o čemu ovisi brzina migracije

Answer 6

1. veličini molekule (fragmenta)
   * manje molekule migriraju brže
2. konformaciji molekule (!!!)
   * jednolančane i dvolančana molekule; specifične strukture
   * dvolančana DNA - linearna, kružna, superzavijena
3. koncentraciji nosača
   * veća koncentracija – manji promjer pora – sporija migracija
   * migriracija je sporija što je koncentaracija nosača veća
4. naponu
   * migracija je brža pri većem naponu
   * previsoki napon – zagrijavanje i lošije razdvajanje
   * uobičajeno 2 do 10 V/cm
   * sekvencioniranje (denaturirajuća poliakrilamidna elektroforeza)
   1700 V (400 V/cm)
5. puferu (elektrolit) – pH=8
   * fosfatni, boratni, acetatn

Question 7

kakav je agarozni gel

Answer 7

stvara ga agaroza, ona se izolira iz morskih algi (rodovi Gelidium i Gracilaria)
pročišćavanjem se uklanjaju drugi šećeri, proteini, soli . . .
prosječna duljina lanaca – oko 800 monomera galaktoze

Question 8

kakva se agaroza koristi za elektroforezu i kakvih još vrsta ima

Answer 8

za elektroforezu se koristi jako pročišćena agaroza
agaroza niskog tališta (“low melting point”) – talište sniženo na oko 65°C

Question 9

koja je konc. agaroze u gelu

Answer 9

0,5 do 2% (do 5%)

Question 10

koji opseg razdavajanja ima agarozni gel

Answer 10

od 100 pb do 25 kb

Question 11

kakav je poliakrilamidni gel

Answer 11

to je polimer akrilamida, akrilamid je toksičan, ima moć razdvajanja molekula kraćih od 2000 nukleotida

Question 12

kakva se elektroforeza provodi kad se koristi poliakrilamidni gel

Answer 12

elektroforeza DNA se često provodi u denaturirajućim uvjetima (elektroforeza jednolančanih molekula)
koristi se i za razdvajanje molekula čija se duljina razlikuje za samo jedan nukleotid
to sve omogućava sekvencioniranje DNA

Question 13

Agarozna vs poliakrilamidna elektroforeza

Answer 13

priprema nosača - kod agarozne e. je jednostavnija, a kod akrilamidne je kompliciranija između dva stakla
uređaji - kao agarozne e. su jednostavniji (horizontalni), a kod akrilamidne su kompliciraniji
koncentracija nosača (%) - agarozna 0,5-2 (5), a akrilamidna 3,5-20
veličina molekula koje se razdvajaju elektroforezom - agarozna 100-25000 pb, akrilamidna kraće od 2000 n

Question 14

nabroji neke uređaje za elektroforezu

Answer 14

Horizontalna agarozna elektroforeza, gel leži u puferu
Vertikalna poliakrilamidna elektroforeza, gel je između dva stakla, najčešće se koristi za elektroforezu proteina
Vertikalna poliakrilamidna elektroforeza, gel je između dva stakla, gel je dugačak jer se koristi za sekvencioniranje DNA
Uređaj za automatizirano sekvencioniranje DNA, poliakril amidni gel u kapilari

Question 15

kako se odabire konc. nosača

Answer 15

odabire se prema očekivanoj veličini fragmenata - manji fragment – veća koncentracija nosača
Za razdvajanje jako velikih fragmenata koristi se elektroforeza u promjenjivom električnom polju (pulsirajuća elektroforeza)

Question 16

koje su komponente boja za nanošenje uzorka

Answer 16

saharoza, glicerol ili fikol (specifična težina veća od vode - omogućuje da uzorak upadne u jažicu)
obojene komponente - xylene cyanol i bromfenol plavo - omogućuju detekciju uzorka, da znamo gdje se nalaze fragmenti DNA i da ne bi izašli iz gela u pufer
Tris-HCl i EDTA (stabilnost)

Question 17

kako se vizualizira DNA

Answer 17

gel, nakon elektroforeze, inkubirati u otopini etidij-bromida (1 μg/ml) 15-20 minuta
interkalira u DNA, apsorbira UV svjetlo i emitira svjetlo valne duljine 590 nm (narančasto-crveno)
etidij-bromd je mutagen

Question 18

elektroforeza dvolančane DNA u agaroznom gelu

Answer 18

elektroforeza se može koristiti za određivanje (procjenu) duljine fragmenata DNA ali samo ako je DNA linearizirana
ne može se koristiti za određivanje duljine cirkularnih (kružnih) molekula DNA (PLAZMIDI) jer te mol. mogu biti super-zavijene te to utječe na brzinu kretanja DNA kroz gel (kreću se brže)

Question 19

kako migrira super-zavijena DNA kroz gel

Answer 19

Više super-zavijena DNA brže migrira
tijekom elektroforeze

Question 20

zašto su kod nekih rezultata elektroforeze donje vrpce slabijeg intenziteta

Answer 20

jer se u njima ukupno nalazi manja količina fragmenata, manja masa DNA, nego u gornjoj vrpci,

Question 21

što je OC

Answer 21

open circle, otvoreni krug

Question 22

što je SC

Answer 22

supercoil, super-zavijeni krug, isto što i CCC- covalently closed circle

Question 23

kakva sve može biti konformacija plazmida

Answer 23

superzavojnica, SC - ne sadrži ni jednolančani ni dvolančani lom
otvoreni, relaksirani, nikirani plazmid (OC) - sadrži jednolančani lom (“nick”)
linearna DNA - sadrži dvolančani lom (DSB) – dva bliska jednolančana loma u komplementarnim lancima

Question 24

o čemu ovisi brzina migracije pojedinih struktura plazmida

Answer 24

ovisi o uvjetima elektroforeze, ali obično najbrže migrira superzavojnica, a najsporije otvoreni krug (relaksirana DNA)
linearni plazmidi u gelu putuju otprilike jednako brzo kao i nikirani plazmidi
velike plazmide (veće od 10 kb) teško je izolirati u obliku superzavojnice

Question 25

primjena elektroforeze DNA

Answer 25

Dijagnostička elektroforeza - provjera bilo kojeg koraka tijekom kloniranja (vježbe) * provjera uspješnosti izolacije ili umnažanja plazmida (DNA) * provjera kvalitete DNA (degradacija, prisutnost nukleaza, prisutnost RNA…) * provjera uspješnosti restrikcije, ligacije… * provjera konstrukcije plazmida (duljina i orijentacija inserta…) * restrikcijska analiza (provjera strukture DNA; izrada restrikcijske mape) Preparativna elektroforeza - izolacija željenog fragmenta DNA iz gela

Question 26

kako znamo da plazmid nije pocijepan

Answer 26

bend najvećeg intenziteta je onaj koji je najniže i vide se bendovi slabijeg intenziteta iznad njega, da je prikazan pocijepani plazmid, bend najvećeg intenziteta bi bio najviši, tj. najsporiji i bili bi drugi bendovi ispod njega

Question 27

kako provjeravamo uspješnost restrikcije

Answer 27

u pozadini ne smije biti razmaza, tj. smearova jer to ukazuje da je uzorak kontaminiran npr. egzonukleazom ili malom količinom genomske DNA koju smo izolirali skupa s plazmidom

Question 28

kako provjeravamo uspješnost kloniranja

Answer 28

konstruirani plazmid pocijepamo na dva mjesta tako da se insert može izolirati te gledamo vidi li se taj insert na rezultatima elektroforeze

Question 29

za što koristimo restrikcijsku mapu

Answer 29

za planiranje kloniranja, insilico kloniranje

Question 30

kako određujemo veličinu nepoznatog fragmenta DNA

Answer 30

Veće molekule migriraju sporije, a manje brže brzina migriranja: V=K∙1/logL (vrijedi samo za linearne dvolančane mol.) Veličina nepoznatog fragmenta određuje se na osnovi usporedbe sa standardom (molekule poznate veličine) Brzina migracije ovisi o nizu parametara pa elektroforezu nepoznatog fragmenta i standarda treba provesti na istom gelu

Question 31

čija DNA se najčešće koristi kao standard

Answer 31

DNA bakteriofaga lambda pocijepana s nukleazom HindIII

Question 32

kako se konstruira graf za određiavnje vel. fragmenata

Answer 32

na x os ide L - duljina puta koji je fragment prošao u gelu na y os ide log pb - log od duljine fragmenata DNA standarda u pb

Question 33

kako određujemo masu (konc.) DNA

Answer 33

na temelju usporedbe intenziteta vrpce (“band-a”) s intenzitetom vrpce u kojoj se nalazi poznata masa DNA (standard) (u 1 μL može biti od nekoliko ng do nekoliko μg DNA)

Question 34

objasni elektroforezu u pulsirajućem el. polju

Answer 34

koristi se za razdvajanje velikih molekula DNA (20 kb do 5 Mb) prvo je potrebno izolirati DNA - velike molekule lako pucaju tijekom manipulacije (pipetiranje, centrifugiranje); DNA se izolira iz stanica koje su imobilizirane u blokićima agaroznog gela; u jažicu se stavlja dio agaroznog blokića i “zalije” agarozom Elektroforeza - DNA se izlaže promjenama smjera električnog polja - ponekad traje i više od 48 sati - potrebno je hlađenje pufera na određenu temperaturu - zamjena i cirkulacija pufera pomoću pumpe - jako kvalitetna agaroza

Question 35

nabroji neke izvedbe pulsirajuće elektroforeze

Answer 35

FIGE, TAFE, RGE, CHEF

Question 36

nabroji neke izvedbe preparativne elektroforeze

Answer 36

Pomoću DEAE-membrane (dietil aminoetil) Elektroelucijom Ekstrakcija DNA iz agaroznog gela niskog tališta (LMP-agaroza) Adsorpcija na staklene kuglice

Question 37

objasni elektroforezu pomoću DEAE-membrane (dietil aminoetil)

Answer 37

membranu postaviti u gel neposredno ispred vrpce koju treba izolirati (iz gela se izreže kocka, postavi membrana i kocka vrati natrag); nastaviti elektroforezu dok se DNA ne veže na membranu; membranu izvaditi iz gela, isprati otopinom niske ionske jakosti te DNA eluirati otopinom visoke ionske jakost

Question 38

što je to elektroelucija

Answer 38

izrezati dio gela koji sadrži željenu vrpcu i staviti u vrećicu za dijalizu vrećicu s gelom vratiti u uređaj za elektroforezu da DNA izađe iz gela i zaustavi se na stijenci vrećice iz pufera istaložiti DNA

Question 39

objasni ekstrakciju DNA iz agaroznog gela niskog tališta

Answer 39

elektroforezu provesti u LMP-agarozi izrezati dio gela koji sadrži željenu vrpcu, dodati pufer te gel otopiti zagrijavanjem 65°C iz otopine pročistiti DNA (agar se ukloni ekstrakcijom s fenolom, a DNA istaloži etanolom); agar se može ukoniti i pomoću agaraze

Question 40

objasni adsorpciju na staklene kuglice

Answer 40

agarozu otopiti u NaI DNA se veže na staklene kuglice s kojih se kasnije eluira