1
Q
Was macht die Peloria Mutante von Linaria vulgaris (echtes Leinkraut) besonders?
A
- Mutation in Methylierungsmuster des Lcyc Gen
- Stark methyliert und Transkription unterdrückt
- Keine klassische genetische Mutation der DNA Sequenz
- Phänotyp ist radialsymmetrisch statt bilateral
Paper: An epigenetic mutation
responsible for natural
variation in floral symmetry
2
Q
Erläutern Sie wie das Muster der Calico cat (Schildpatt Katze) zustande kommt. Auf welchen epigenetischen Prinzipien basiert es?
A
- Tritt bei weiblichen Katzen auf
- Fellfarbe ist X-Chromosomaler kodominanter Erbgang (schwarz/rot)
- Bei heterozygoten Katzen tritt eine Mosaikmusterung auf, die nicht genetisch determiniert ist
- X-Chromosom Inaktivierung in der Embryonalentwicklung ist zufällig (Stochastische Inaktivierung)
- Die Inaktivierung wird an die Tochterzellen weitervererbt, dadurch Regionen einer Fellfarbe im adulten Tier (Klonale Vererbung)
Zusatz:
- Bei Klonung einer Katze aus einer Zelle, bleibt die jeweilige Inaktivierung bestehen. Somit einfarbiges Fell
- Bei männlichen Katzen ist dieses Fellmuster z.B. über Klinefelter-Syndrom (XXY) erklärbar. Diese Katzen sind allerdings unfruchtbar
3
Q
Definieren Sie Epigenetik
A
- Vererbbare Phänomene in der Genfunktion (mitotisch und/oder meiotisch), die nicht durch Veränderungen in der DNA Sequenz erklärt werden können
- Chemische Grundlage: Veränderungen am Chromatin, DNA-bindende Proteine oder DNA-Methylierung
4
Q
Vergleichen Sie Genetik und Epigenetik
A
- Genetik: Bestimmt durch DNA-Sequenz
- Mutationen treten bei Basen auf. Wenn in Keimbahn, dann vererbbar
- Epigenetik: Liefert Erklärung für Zelldifferenzierung oder paternale/maternale Vererbung (Imprinting)
- Mutationen treten bei der Modifikation der DNA und der assozierten Proteine auf
- Epigenetische Änderungen sind umkehrbar, Genetische nicht
5
Q
Was versteht man unter “epigenetic landscape” (Conrad Waddington)?
A
- Ein Genom, viele Epigenome (Zelldifferenzierung)
- Theoretisch möglich: Differenzierung aufheben und Zelltypen ineinander umwandeln
- Epigenetisch ähnliche Zelltypen wären dabei leichter umwandelbar
6
Q
Nennen Sie writer für 1) Acetyl-Lysin 2) Serin/Threonin-Phosphat 3) Methyl-Argenin 4) Methyl-Lysin
A
1) Histon-Acetyl-Transferase (HAT)
2) Kinase
3) Protein arginine Methyltransferase (PRMT)
4) Lysin(K) Methyl-Transferase (KMT)
7
Q
Nennen Sie reader für 1) Acetyl-Lysin 2) Serin/Threonin-Phosphat 3) Methyl-Argenin 4) Methyl-Lysin
A
1) Bromo-Domain
2) SANT-Domain
3) Tudor-Domain
4) Chromo-Domain
8
Q
Nennen Sie eraser für 1) Acetyl-Lysin 2) Serin/Threonin-Phosphat 3) Methyl-Argenin 4) Methyl-Lysin
A
1) Histon-Deacetylase (HDAC)
2) PPTase
3) protein arginine deiminases (PAD)
- ändert aber die Aminosäure (zu Citrullin)
4) Lysin(K) Demethylase (KDM)
- Aminoxidase oder Hydroxylase
9
Q
Nennen Sie 3 epigenetische Mechanismen
A
1) chemische Modifikation der Histone (posttranskriptional)
2) Modifikation der DNA (z.B. Methylierung)
3) Verschiebung der Nukleosomenposition (Chromatinremodeling)
10
Q
Beschreiben Sie die Zusammensetzung eines Histon-Oktamers.
A
- Besteht aus H2A,H2B,H3 und H4 Untereinheiten
- H2A/H2B bilden Dimere
- H3/H4 Tetramere
- 2x H2A/H2B + 2x H3/H4 bildet Histon Oktamer
- zusammen mit 147 bp DNA -> Nukleosom
11
Q
Beschreiben Sie den Aufbau des Nukleosoms.
Was ist die Dyad Achse?
A
- Histon-Oktamer + 147 bp DNA
- 2 Umwicklungen der DNA (links rum) um das Histon-Oktamer
- H3/H4 oben
- H2A/H2B unten
-Dyad-Achse: Ein- und Austrittsstelle der DNA am Histon-Oktamer
12
Q
Was ist die Rolle von H1?
A
- Linker Histon
- Basenpaar länge (147) um Histonoktamer bleibt unverändert
- Linkerlänge (Abstand zum nächsten Nukleosom=Linker DNA) ändert sich
- Dadurch kompaktere Packung -> 30nm Struktur des Chromatins
13
Q
Wie beeinflusst H1 die Chromatin Struktur? Welche Extratkionsformen gibt es?
A
- H1 anwesend: 30nm Struktur (Niedersalz-Extraktion)
- H1 abwesend: 10nm Struktur (Hochsalz-Extraktion)
14
Q
Was ist die Histon-fold domain? Was lässt sich über das C- und N-Terminale Ende aussagen?
A
- Histon-fold domain: eine kurze, eine lange, eine kurze Alpha Helix.
- diese greifen ineinander um Quartärstruktur zu bilden
- C- und N-Terminales Ende sind flexibel. Sowohl räumlich als auch im Bezug auf die länge zu anderen Untereinheiten
15
Q
Erläutern Sie die Unterschiede zwischen DNAse und MNAse. Welche Rolle spielt hier der limitierte Verdau?
A
- DNAse: Sensitive Stelle für DNA ohne Chromatin (Nachweis für Transkriptionsfaktoren)
- MNase (Micrococcal nuclease): Sensitive Stelle für Linker-DNA (Nachweis für Histonpositionen)
-Limitierter Verdau: Sensitive Stellen werden zuerst verdaut
16
Q
Nennen Sie signifikante Eigenschaften des Heterochromatins.
A
- Dichter (starke Anfärbung)
- Wenig Genexpression
- Genarm
- Bindung von Heterochromatinproteinen (HP-1,SIR2/3/4)
- Hypoacetyliert (wenig)
- Konstitutives Heterochromatin: H3K9 Me
- Fakultatives Heterochromatin: H3K27 Me
17
Q
Nennen Sie signifikante Eigenschaften des Euchromatins.
A
- Locker (schwache Anfärbung)
- Gute Genexpression
- Genreich
- Hyperacetyliert (viel)
18
Q
Nennen Sie chemische Modifikationen die an Histonen auftreten. Wo treten diese vorwiegend auf?
A
- Acylierung (R-C=O)
- Acetylierung an Lysin (CH3-C=O)
- Methylierung an Lysin und Arginin
- Phosphorylierung
- Ubiquitinierung/Sumoylierung (kleine Proteine)
-Treten am großteils am N-Terminus auf
19
Q
Was lässt sich über die Aminosäure-Sequenz und die Modifikationen der Histone aussagen?
A
Sind extrem stark konserviert
20
Q
Wodurch werden die Modifikationen vorgenommen, die für die Transkription nötig sind?
A
- SAGA Komplex
- Enthält:
1) Histon Acetyltransferase
2) Deubiqutinierung
3) Faktoren die mit TATA-Box Proteinen interagieren - Wichtig für die Transkription
- Auch wichtig für export der mRNA
21
Q
Nennen Sie ATP abhängige Chromatin remodler. Welche Funktionen übernehmen diese?
A
1) SWR1-Komplex:
- enthält Protein aus der SWI/SNF Familie (Swr1)
- katalysiert den austausch von Histonvarianten (H2AZ-H2B Dimere)
2) NuA4/Tip60-Komplex:
- Histon Modifikation
- Histonacetylase Funktion (mit ATP und Acetyl-CoA)
3) INO80-Komplex:
- Chromatinremodler; verschiebt Nukleosomen
Funktion: DNA Reparatur, Zellzyklus/Replikation, Genregulation
22
Q
Was bedeutet “cross talk” und “cross tail”?
A
Cross talk:
-Modifikationen in direkter Nachbarschaft beeinflussen sich (sterische Hinderung)
Cross tail:
-Modifikation an einem N-Terminus beeinflusst ein Modifikation am N-Terminus einer anderen Histonuntereinheit (“unintuitiv”)
23
Q
Wie funktioniert die Lysin Acetylierung? Wie ist die Notation?
A
-Durch HistonAcetylTransferase (HAT)
-Acetyl-CoA liefert Acetylgruppe
-Acetyl am epsilon-Ende des Lysins
-Positive Ladung geht verloren, da NH3+ nicht mehr vorhanden
Notation: H3K5,8,12 Ac (Histonuntereinheit 3 ist an den Lysin mit Position 5,8 und 12 acetyliert)
24
Q
Nennen Sie die HAT Familien. Wie werden diese klassifiziert?
A
-Klassifikation nach Homologie
1) HAT1: H4K5,12 Ac
-direkt nach Synthese im Cytoplasma
2) Gcn5/PCAF:
Gcn5: vorwiegend H3 Acetylierung, etwas H2B
-Acetylierung in Nähe des Promotors
-Teil des SAGA-Komplexs (Transkriptionsaktivatorkomplex)
3) MYST: H4 Ac
MOF: H4K16 Ac
-Dosis-kompensationskomplex in Drosophila
Ybf2,Sas3:
-Teil von NuA3
-Transkriptionsaktivierung
Tip60:
-Teil eines Komplexes mit HAT Aktivität
-Chromatin remodeling
4) p300/CBP: H3 und H4 Ac
CBP = CREB-binding protein
CREB = cAMP response element binding protein
-Nur bei Tieren, aber strukturelle Homologie zu Rtt109
5) Rtt109: H3K56 Ac
-Nur in Pilzen (gibt diese Modifikation somit auch nur in Pilzen)
-keine Primärsequenzhomologie
25
Was lässt sich über die Struktur der HATs aussagen?
- Acetyl-CoA sitz als Cofaktor im Zentrum
- Beta Sheets aus 3 Strängen + alpha Helix
- Strukturelle Ähnlichkeiten aber keine direkte Homologie
26
Was ist das Problem mit HAT Inhibitoren?
- sind nicht selektiv ->Nebenwirkungen
- wirken nur bei hohen Konzentrationen
- nicht wirklich therapeutisch geeignet
- > Es gibt Inhibitoren aber keine Medikamente
27
Nennen Sie Mechanismen und Funktion der Histonacetylierung.
Mechanismus:
- Elektrostatische Wechselwirkung
- Spezifität des Readers zum Acetyl ->erhöhte Affinität der Bindung
- Reader sind Teil von Proteinkomplexen, daruch Funktion vermittelt
Funktion:
- Transkriptionsaktivierung
- Replikation
- DNA-Reparatur
- Histon-Import in Zellkern (HAT1)
28
Was ist der Reader der Histonacetylierung (Lysin)? Was lässt sich über die Inhibitoren im vergleich zu den HAT-Inhibitoren aussagen?
- Bromodomain, besteht aus tandem repeats
- Acetyl-Lysin Bindestelle
- 56 verschiedene Bromodomainen beim Menschen
- Inhibitoren zwischen Bromodomain und Bindepartner sind selektiver -> weniger Nebenwirkung
29
Welche Histon-Acylierungen können auftreten? Was sind Writer, Reader und Eraser?
1) Propionyl
2) Crotonyl
3) Succinyl
4) Malonyl
- Acylierungen treten seltener auf auf Acetylierung
- Reader sind Acetylation-Reader: BRD, (YEATS, Double PHD, Double PH, non canonical BRD)
- Writer sind Acetyltransferasen (mit Co-Faktor = Acyl-CoA)
- Eraser: Deacetylasen können auch deacylieren
30
Nennen Sie Klassen von Histondeacetylasen. Was lässt sich über die Inhibitoren aussagen?
1) Class I - Rpd3 like
2) Class II - Hda1 like
3) Class III - Sir2 like (Sirtuin 2)
- Sirtuin: NAD+ abhängige Histondeacetylase. Teil des SIR 2/3/4 Heterochromatin Komplexes. SIR-Komplex -> Silencer Komplex
4) Class IV - HDAC 11
(Klassen I,II und IV sind ähnlich)
- HDAC Inhibitoren:
- In geringer Dosis wirksam. Bereits klinische Anwendung
- Sirtuin Inhibitoren:
- Chemische verschieden von HDAC Inhbitoren.
- In Testphase für Krebstherapien
31
Wie funktioniert die Genaktivierung? Was bedeutet Feedback?
- Durch Nukleosomverschiebung und Acetylierung
- An UAS (upstream activator sequence) binden Transkriptionsaktivator -> rekrutiert HAT
- Acetylierung sorgt für "auflockerung" des Chromatins, da positive Ladung entfernt (experimentell nur für eine Stelle bestätigt)
- Acetylierung kann von Bromodomainen erkannt werden, diese sind oft Teil von großen Komplexen mit Auswirkungen auf das Chromatin
- Bindung von RNA Polymerase II ermöglicht
- Diese Hilft bei Rekrutierung von Methyltransferase (Set1 und Set2)
- H3K4Me3 (durch Set1, in Promotornähe) wirkt Transkriptionsaktivierend
- H3K36Me (durch Set2, gesamter ORF) wichtig für Elongation
Feedback: Stellt den urspünglichen Zustand des Chromatins nach der Transkription wieder her
32
Wie funktioniert die Genrepression?
- An URS (upstream repressive sequence) binden Transkriptionsrepressoren -> rekrutiert HDAC (z.B. Rpd3)
- HDAC sind Teil von Proteinkomplexen, welche dann repressiv auf die Transkription wirken
- Rpd3 besitzt außerdem Chromodomain die an ORF (open reading frame) bindet, wenn dieser als H3K36Me vorliegt
- Unterdrückt Initation der RNA Polymerase II
- >Verhindert somit, dass Transkription in mitten des ORF startet
33
Welche Histonmethylierungen können auftreten? Was sind unterschiede zur Histonacetylierung?
```
Lysin-Methylierung:
mono-, di-, tri-
-Positive Ladung geht hier nicht verloren
Arginin-Methylierung:
mono-, di-
```
-Acetylierung wirkt allgemein aktivierend auf Genexpression, Methylierung hat unterschiedliche Folgen je nach Methylierungsstelle
34
Was sind die Writer der Histonmethylierung?
- Histonmethyltransferasen (HMT):
1) SET
2) Dot1
35
Was sind typische stellen der Histonmethylierung. Durch welche Enzyme werden sie vermittelt und welche Funktion folgt daraus?
```
1) H3K4 durch Set1:
Me3: Transkriptionsinitation im 5'-Bereich des Gens (Promotornähe)
Me1: Enhancer
Me1 + H3K27Ac: Aktive Enhancer
2) H3K36Me3 durch Set2:
- Transkriptionselongation
3) H3K79 durch Dot:
-Verhindert Heterochromatin
4) H4K20 durch Set7:
Me1: wirkt aktivierend
Me3: wirkt repremierend
5) H3K9Me durch Suv39:
-Repression
-Konstitutives Heterochromatin
6) H3K27Me3 durch Ezh2/Polycomb:
-Aufrechterhaltung der Repression (z.B. Hox-Gene)
-Fakultatives Heterochromatin
```
-> Keine einheitliche Wirkung der Methylierung
36
Was ist fakultatives und konstitutives Heterochromatin?
Fakultatives Heterchromatin:
-Nur in einige Zellen des Organsimus (z.B. X-Chromosom Inaktivierung)
Konstitutives Heterchromatin:
-In allen Zellen des Organsimus an der gleichen Stelle gebildet (z.B. am Zentromer oder Telomer)
37
Welche Typen von Arginin-Methylierung gibt es?
-Mono-Methyl Arginin
-Di-Methyl Arginin:
symmetrisch (dursch PRMT Klasse I) oder antisymmetrisch (durch PRMT Klasse II)
38
Wie wird Lysin demethyliert? Was sind die Substrate?
1) Oxidation durch Aminoxidase (hier: LSD = Lysine specific demethylase)
Substrat: -Me2, -Me1
-Oxidation geschiet durch Einführung einer Doppelbindung. Daher -Me3 nicht möglich, da Stickstoff 5 Bindungen haben würde
2) Hydroxylierung durch Jumonji domain protein
Substrat: -Me3, -Me2, -Me1
39
Wie wird Tri-methylierung erkannt?
PHD-Finger (H3K4Me3-> Transkriptionsinitation)
| -Meist Lysin Methylierung kann aber auch zum Teil Mono- und Dimehtyl-Arginin
40
Wie bindet SIR3 an das Nukleosom? Wann bindet es nicht?
- Über die BAH (bromo-adjacent homology)-Domain
- Bindet an Nukleosom und Histon-N-Terminus
- Bindet nicht bei H4K16Ac oder H3K79Me
41
Nennen Sie Methyl-Lysin bindende Module. (Reader)
1) Chromodomain
- HP1: H3K9Me binden (konstitutives Heterochromatin)
- Polycomb: H3K27Me (fakultatives Heterochromatin)
- MSL3: H4K20Me1 (Teil von Dcc in Drosophila)
- Eaf3: H3K36Me (Teil von Rpd3-Komplex = HDAC)
2) Tudordomain
3) PWWP-Domain (Pro-Trp-Trp-Pro)
4) PHD-Finger (Meist Lysin manchmal Arginin)
42
Wie erfolgt die Arginin Demethylierung?
1) Umwandlung in andere Aminosäure (Citrullin) durch PADI4 (Peptidyl arginine deiminase, type IV)
2) Manche Jumonji Proteine können auch Arigin demethylieren
43
Warum spricht man von koordinierten Chromatin Modifikationen?
- Da sich die Modifikationen untereinander beeinflussen
| - Können inhibierende oder begünstigende Wirkung haben
44
Erläutern Sie das Prinzip von ChIP.
- ChIP = Chromatin Immunpräzipitation
- Nachweis von Interaktion bestimmer Proteinen mit der DNA (an welche Sequenz diese Proteine binden)
1) Crosslink mit Formaldehyd (Kovalente Bindung von Protein mit DNA)
2) Chromatinschere -> Kürzere Segmente des Chromatins
3) Antikörper mit "magnetic beads" die spezifisch für das jeweilige Protein sind -> Extraktion des Proteins
- Nutze Kontrolle um Refrenzwert zu haben, was sowieso extrahiert werden würde
4) Reverse Crosslink
5) DNA Isolierung
6) Analyse mit:
- qPCR (Fluoreszenzkurve)
- ChIP on Chip: Hybridisierung mit Microarray
- ChIP-Seq: ganzes Genom, weniger Hintergrundrauschen, bessere Auflösung, Sequenzierung und Alignment
45
Was sind Unterschiede zwischen ChIP-qPCR, ChIP on Chip und ChIP-Seq?
1) qPCR = quantitative PCR (Analyse während aller Reaktionsschritte)
- Nutzt entsprechende Primer
- Fluoresezenz verursacht durch Marker der in dsDNA interkaliert (Signal verstärkt)
- Somit Fluoresenzenz Signal proportional zum Fortschritt der PCR Reaktion
- Ct-Wert (Cycle Threshold): Gibt an, nach wieviele Zyklen das Signal über Hintergrundrauschen steigt
- Ct-Werte können verglichen werden, liefern Auskunft über die Anfangskonzentration der Probe (weniger Zyklen nötig, wenn Anfangskonzentration hoch)
2) Microarray
- Nur teile des Genoms
- Fluoreszenzsmarkierung
- DNA Fragmente binden an bekannte Sequenzen des Microarrays
- Färbung des Microarrays nach waschen
- Geringe Kosten
- Schnelle und einfache Analyse
- Dafür schlechtere Auflösung und mehr Hintergrundsignal als ChIP-Seq
3) Sequenzierung generiert "Reads"
- Ganzes Genom
- Base calling aus Bilddaten
- Aligment der Reads auf bekanntes Genom
- "Peak-calling" (Statistische Analyse; was ist ein echtes Signal?)
- Computermodellierung/-auswertung
46
Welche erweiterenden Analysmethoden gibt es zu ChIP?
1) MNAse-Seq: Peaks an den Stellen, wo sich Nukleosomen befanden
2) DNAse-Seq: Peaks and den Stellen, wo sich freies Chromatin befand
3) Chromosome conformation capture (3C)
- 4C: circular Chromosome conformation capture
- 5C/HiC
47
Erläutern Sie die unterschiedlichen Typen 3C, 4C, 5C und HiC.
Prinzip: Welche Loci liegen im 3D Raum nah beieinander, sind aber genomisch weit entfernt?
- Grund hierfür z.B. Promotor-Enhancer Interaktion
- Methoden unterscheiden sich darin, wieviele Teile sie miteinander vergleichen
Generelle Methodik:
- Chromatin Crosslinken (z.B. Formaldehyd)
- Schneiden mit Restriktionsenzym
- Ligation
- Verdau der DNA
- Reverse Crosslink
3C - chromosome conformation capture (one vs one):
-quantitative PCR mit bekannten Primern
4C - circular chromosome conformation capture(one vs all):
-Zweiter Ligationsschritt erzeugt Zirkuläres Segment
-Inverese PCR
-Microarray oder Sequenzierung
5C - Chromosome conformation capture carbon copy (many vs many):
-Ligation von universellen Primern
-PCR
-Geringer Anwendungsbereich
-Microarray oder Sequenzierung
HiC (all vs all):
-Enden auffüllen mit Biotin
-DNA Extraktion über Biotin pulldown (mit streptavidin)
-Hochdurchsatzsequenzierung
48
Was sind TADs?
Topologically associated domains
- Chromosomen liegen in Territorien vor
- Selbst interagierende genomische Regionen
- Sequenzen innerhalb einer TAD interagieren häufiger miteinander (Trennung durch TAD Boundaries)
- Es gibt aktive und repremierende Regionen (Eu- und Heterochromatin)
- Heterochromatin viel am Rand
- Euchromatische Regionen nehmen mehr Platz ein
- Somit nimmt aktives X-Chromosom bei weibchlichen Säugern mehr Platz ein als das inaktive
- Wichtig für Enhancerinteraktion (große genomische Distanz, aber räumlich nah beieinander)
49
Welche Fabriken gibt es im Zellkern? Was ist hierbei das Prinzip?
Transkriptionsfabriken, Replikationsfabriken und Reparaturfabriken
-Die entsprechenden Enzyme liegen akkumuliert vor und die DNA wird "durchgezogen"
50
Was sind Histon-Varianten? Welche gibt es?
-Sind Homologe zu Histonen (von eigenem Genom)
H3:
-CENP-A (zentromerische H3 Variante)
-wichtig für Bildung des Zentromers und Chromosomenseparation in Zellteilung
-H3.3: bei aktiver Transkription eingebaut
-H3.1: bei Replikation eingebaut
H2A:
-macro H2A: an inaktivem X-Chromosom
-H2A-Bbd (Barr-body-deficient): Aktives X-Chromosom und Autosomen
-H2A.X: Phosphorylierung bei DNA-Schäden. Wichtig für Reparatur
-H2A.Z: an -1/+1 Nukleosom um TSS (TranskriptionsStartStelle)
51
Was lässt sich über die Orientierung der Basen am Histon aussagen? Was über die Promotorregion?
G-C reiche Region: Außenseite des Nukleosoms
A-T reiche Region: Innenseite des Nukleosoms
- Abwechselnd AT/GC ->Nukleosompositionierung
- AT-Strechtes -> nucleosome depleted region (NDR)
Promotor-Region (AT reich): Großteils frei von Histonen
52
Was lässt sich über die Positionierung der Histone um die TSS aussagen?
TSS = TranskriptionsStartStelle
(Messung der Nukleosompeaks über MNase Seq)
+1 Nukleosom, nach Promotor genau positioniert
-1 Nukleosom weniger genau positioniert
-1,0,+1 Nukleosom sind durch DNA Sequenz vorgegeben
alle weiteren +2,+3,+4... durch Zelluläre Faktoren vorgeben (keine Messung in vitro)
an -1/+1 Mischung auf H2A und H2A.Z
53
Welche expliziten Aufgaben übernehmen Chromatin Remodler? Was haben diese gemeinsam?
- Besitzen alle ATPase Domain
1) Nukleosom sliding
2) Histon exchange
3) Nukleosom eviction
4) Nukleosom assemby
5) Nukleosom spacing
54
Nennen Sie Arten von Chromatin Remodlern. Welche Auswirkungen haben sie auf die Nukleosomenposition um die TSS?
1) Swi2/Snf2 like (switch/sucrose-non-fermenting)
- ein Gen
2) ISwi (imitation switch)
3) RSC (remodels structure of chromatin)
4) CHD (chromodomain)
5) Ino80
- Ino80 Komplex
- Swr1 Komplex (H2A.Z austausch)
- Meiste Remodler Teil von großen Komplexen mit weiteren Auswirkungen auf das Chromatin
- Chromatin Remodler Komplexe legen die Position von +2,+3,+4,... Nukleosomen in vivo fest
55
Wie entsteht die Komplexität eines Organismus?
Nicht durch Anzahl der Gene sondern verschiedene Möglichkeiten der Genexpression
56
Vergleichen Sie Prokaryoten und Eukaryoten in Hinsicht auf die Komplexität der Genexpression
Prokaryoten:
-Promotor und davor Aktivator oder Silencer
Eukaryoten:
- Promotor selbst komplexer
- Enhancer (upstream, downstream, distal, proximal)
- > Unterschiedliche Ergebnisse in Aktivität
57
Nennen Sie die Auswirkungen von Methylierungen an den entsprechenden Stellen.
- H3K27Me3: fakultatives Heterochromatin (Ezh2/Polycomb)
- H3K9Me: konstitutives Heterochromatin (Suv39)
- H3K36Me3: aktive Transkription (Set2)
- H3K4Me1 + H3K27Ac: Aktive Enhancer (p300)
- H3K4Me1: Enhancer
- H3K4Me3: Aktive Promotoren (Set1)
58
Was sind "even skipped (eve) genes"? Wie werden sie reguliert?
- Segmentierungsgene im Drosophila Embryo
- Jeweilige Enhancer verursachen Expression einer bestimmten mRNA im jeweiligen Segment -> Proteine in diesem Segment
- Segementierung entspricht nicht reinfolge auf dem Genom
59
Erläutern Sie die Prozedur von Sanger Sequencing.
| Was sind Vor- und Nachteile?
1) DNA fragmentieren
2) Fragmente in Plasmid aufnehmen und Amplifikation in Bakterien
3) PCR mit dNTPs und ddNTPs, welche Reaktion beim Einbau stoppen (Hydroxygruppe fehlt; Einbau zufällig)
- Für jede Base ein ddNTP mit Fluorophor (unterschiedliche Emission)
- > PCR Produkte mit unterschiedlicher Länge
4) Anordnung der PCR nach Länge und Sequenzbestimmung aus Farbe
- Aufwendig und langsam, dafür künstig
60
Erläutern Sie die Prozedur von Next Generation Sequencing. Was sind Vor- und Nachteile?
1) DNA fragmentieren
2) Ligation von Adaptoren
3) Adaptoren binden durch Komplementäre Basenpaarung in einer Region
4) Mehrere PCR Zyklen sorgen für Amplifikation eines DNA Fragments im jeweiliger Region
5) Zyklisches einbauen von Nukleotiden mit Fluorphor (immer nur ein Nukleotid, dann Messung der Emission)
6) Unterschiedliche Regionen emittieren dann Licht was zu einer Base korrespondiert (Base calling)
7) Wiederholung der Zyklen für Sequenz der Fragmente
8) Software fügt überlappende Segmente zusammen für gesamte Genomsequenz
Vorteile:
- Keine Klonierung nötig
- Schnelle Sequenzierung
Nachteile:
- kurze Fragmente (50-300 bp), daher Referenz Genom nötig
- Teures Equipment nötig
61
Wie unterscheidet sich Third Generation Sequencing von NGS?
- Nutzt keine PCR
- Längere Reads (5-20kb)
- Dafür ungenauer
- Kombination von beiden. TGS für Kontext und NGS für Genauigkeit
62
Wie tritt DNA Methylierung auf?
- Als 5-methyl-Cytosin (Kurz: m5c oder 5mc)
| - Meist beide Stränge methyliert
63
Was sind Writer der DNA Methylierung? Was sind ihre Funktionen?
DNA methyl transferasen (Dnmt)
1) Dnmt1: Maintance Methylierung
- Aufrechterhaltung der Methylierung, da bei Replikation nur Standardbasen eingebaut (sonst "Verdünnung" der Methylierung)
- PCNA-Domain: bindet an PCNA (Ringklemmen)-Protein, das die DNA während der Replikation umgibt
2) Dnmt2: (tRNA- Methyltransferase)
3) Dnmt3a: de novo Methylierung
- PWWP-Domain bindet H3K36Me2/3
4) Dnmt3b: de novo Methylierung
64
Was sind Eraser der DNA Methylierung? (Demethylierung)
1) Passiver Verlust der DNA Methylierung duch DNA-Replikation (Bezogen auf Zellpopulation)
2) TET-Enzyme (Ten-eleven-translokation)
-Katlysieren 5mC zu 5hmC zu 5fC zu 5caC
(Methylcytosin zu Hydroxymethylcytosin zu Formylcytosin zu Carboxylcytosin)
-5-Formylcytosin und 5-Carboxycytosin werden als DNA-Schaden erkannt
-Durch TDG (Thymin-DNA-Glykosylase) rausgeschnitten
-Über Basenextinktion Reparatur ersetzt
-Somit wieder Cytosin
3) Hydrolytische Desaminierung
-5mC->Thymin
-Hier besteht 50%/50% Chance, dass C oder A erstezt wird
-Wenn A eingebaut wird, ist eine Mutation aufgetreten
Hingegen wird Cytosin->Uracil und dann immer durch C ersetzt, da U nicht in DNA auftritt
65
Erläutern Sie den Prozess der Bisulfit Behandlung? Wozu wird es genutzt?
Anwendung:
- DNA-Bisulfit-Sequenzierung
- Herausfinden, welche Stellen in der DNA methyliert vorliegen
Prozess:
-Bisulfit Reagenz ändertz C->U, wohingegen 5mc und 5hmc unverändert bleiben (Bisulfitkonvertierung)
-PCR-> U aus DNA wird zu T. 5mC werden zu C (nur Standardbasen eingebaut)
-Direkte Sequenzierung (Hochdurchsatz/NGS)
oder Subklonierung (nur 1 Molekül eingebaut->keine Überlagerung von C und T Peaks bei Sequenzierung) und anschließend Sanger-Sequenzierung
66
Was sind CpG-Inseln? Was lässt sich hier über die Methylierung aussagen?
CpG-Inseln: Region mit hohem vorkommen an CpG-Dinukleotiden
- Liegen meist unmethyliert vor
- Hingegen sind die CpG-Dinukleotide meist methyliert
- Wenn CpG Insel am Promotor, wird Gen nur exprimiert, wenn dieser unmethyliert vorliegt
67
Was sind Probleme bei der "Whole Genome" Bisulfit Sequenzierung?
- Bei kleiner Methylierungsrate, ist es Fehleranfällig
- Bisulfitkonvertierung erfolgt nicht mit 100% Effizienz
- Kein Aussage möglich, ob Methylierung oder Hydroxymethlierung vorlag
68
Nennen Sie weitere Möglichkeiten um Methylierung der DNA nachzuweisen. (Außer Bisulfitkonvertierung)
1) Me-DIP = Methyl-DNA-Immunopräzipitation
- MeDIP-Chip (Microarray) oder MeDIP-Seq (Hochdurchsatz)
- Antikörper gegen 5mC
- Hier aber auch Problem: Müsste 5mC von 5hmC unterscheiden können. Ist nicht 100% akkurat
2) HPLC/MS (Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung)
3) Methylierungssensitive Restriktionsenzyme
69
Was ist Hydrolytische Desaminierung? Was ist das Problem hierbei?
- Natürlich auftretender Prozess
- 5mC -> T
- C->U
- Das Uracil wird in DNA als Schaden erkannt und korrekter weise durch Cytosin ersetzt
- bei Auftreten von Thymin, ensteht "falsche" Paarung mit gegenüberliegender Base (nämlich Guanin)
- Hier besteht 50%/50% Chance, dass ein C oder A eingebaut wird
- >Mutation wenn A eingebaut wird. Häufige Mutation beim Menschen
- >DNA-Methylierung verursacht Mutation
70
Wie wird die DNA Methylierung "ausgelesen"?
1) Faktoren, die durch Methylierung nicht mehr an die DNA binden
- Cfp1, besitzt CXXC-Motiv, welches unmethylierte CpG Stellen bindet
- Kdm2a, Kdm2b (CXXC-Motiv)
- CTCF bindet ebenfalls unmethylierte CpG reiche Stellen
2) Faktoren, die Methyl-Cytosin binden
- MBD-bindende Proteine (=Methylcytosin-bindene Domain)
- Kasio (Zinkfinger-Proteine)
- SRA-Domain (SET- and RING associated domain)
71
Welche Proteine binden unmethylierte CpG Stellen?
CXXC-Proteine
- Cfp1
- Kdm2a
- Kdm2b
72
Welche Proteine binden Methyl-Cytosin?
- MeCP2
- MBD1
- MBD2
- MBD3
- MBD4
- Kaiso
- UHRF1 (kann auch noch 2 methylierte Histonstellen binden)
73
Erläutern Sie, warum ein Input Signal bei ChIP nötig ist.
- Chromatin ist entlang des Genoms ungleich
- Offenes Chromatin bricht leichter
- Ungleichmäßige Fragmentierung
- Input Signal (DNA+Histon), um festzustellen, ob "echtes" Signal oder Peak durch Histon
74
Was ist Mock IP?
-Mock Immunopräzipitation
-DNA Extratktion mit Antikörper, der bekannter maßen nicht and DNA bindende Proteine bindet
(Form der Kontrolle)
75
Erläutern Sie Paired-End sequencing, Depth of sequencing/coverage und Multiplexing.
Paired-End sequencing:
- Sequencing der Fragmente von beiden Seiten
- Verbessert Lokalisation der Fragmente am Genom (besonders in repetitiven Sequenzen)
- Verbessert Peak calling
- 2-fache Kosten
- z.B: Proteine die an mehrere Fragmente binden, brauchen mehr Fragmente für besseres Signal zu Rausch Verhältnis
Depth of sequencing/covarage:
- Relevante Regionen wären Mehrfach sequenziert
- Reduziert Fehlerrate
Multiplexing:
- Mehrere Genomabschnitte gleichzeitig zu sequenzieren
- Barcodesequenz für Zuordnung
76
Was sind Herausforderungen beim Sequenz-Mapping (zum Referenzgenom)?
- Gewaltige Anzahl an Fragmenten
- Große Genome
- Kurze Fragmente
- Repetitive Segmente
- Fehler bei Sequenzierung und Mutationen
- Muss schnell und Effizient sein
77
Was ist Peak Calling und Normalisierung?
Peak calling:
- Position der signifikanten Peaks
- Unterteilung in "Bins"
- Mittelwert von Experiment zur Kontrolle
- Differenz liefert Peak
Normalisierung:
- Daten normalisieren
- Für vergleich von unabhängigen Messungen
78
Was passiert nach dem Peak Calling?
- Visualisierung:
- z.B. Genombrowser. Dort wo Transkriptionsunterdrückende Faktoren sind, sind keine Anzeichen von Transkription (aktive Enhancer/Promotoren) und umgekehrt
- Korrelation mit anderen Daten
- Entdeckung von Bindungssequenzmotiven
- "Gene Ontology " Analyse
79
Was sind Heat-Maps?
- Für Darstellung multidimensionaler Daten
- Im Prinzip Tabelle, in der Werte durch Farbe dargestellt
z. B: Enhancer sind in allen Zelllinien vorhanden, aber nicht immer aktiv
80
Wie erfolgt die Analyse von Hi-C?
- Welche Chrosomenregion interagieren miteinander? (Sind räumlich nah beieinander. Wichtig z.B. für Enhancer)
- Diagonale bedeutet selbe Position
- "Kästchen" um die Diagonale geben Stellen mit Chromatin-"Knäuel" an
- Interagierende DNA stellen. Räumliche Nähe
81
Was ist die Funktion von Insulator Proteinen?
- Bringen Chromatin zusammen (bilden Loops->Gen nah an Enhancer) oder auseinander (->Gen entfernt von Enhancer)
- Wichtig für TADs und Abgrenzung von aktiven Chromatin und Heterochromatin
- Wenn Insulator Protein fehlt, dann TAD nicht abgerenzt und Heterochromatische Sturkur reich bis in aktive Strukutr
- Dadruch Inaktivierung der Sequenz
82
Was ist ENCODE?
Enzyklopädie der DNA Elemente
| -Versucht alle funktionalen Elemente des menschlichen Genoms zu klassifizieren
83
Was ist das Problem mir Korrelation und Kausalität?
- Korrelation bedeutet nicht zwingend Kausalität
| - Weitere Experimente nötig um Kausalität festzustellen
84
Was versteht man unter Heterogenität der Probe? Wie kann dieses Problem umgangen werden? Was sind Vor- und Nachteile?
-Selbst Zellen einer Kultur sind unterschiedlich
-z.B: Größe, Phase des Zellzyklus, Genexpression
-> Mittelwert aus Millionen von Zellen
Daher: Single Cell genomics
Vorteile:
- Gibt Auskunft über Zellzyklus, Heterogenität und Genexpressionsrate
- Rekonstruktion von Gewebe möglich
Nachteile:
- Kompliziert
- Teuer
- Geringe Mengen an Daten für jeden Zelltyp
85
Was ist das Zentrale Dogma? Wie leiten sich daraus Single Cell genomics und Single Cell Multi-nomics ab?
Zentrales Dogma:
- DNA wird repliziert
- DNA in RNA
- RNA in Proteine
Single Cell genomics:
- DNA: Genom, Epigenom
- RNA: Transkriptom
- Proteine: Proteom
Single Cell Multi-nomics:
- Kombination der Single Cell genomics
86
Welche Analyse können Sie durchführen, um Rückschlüsse des Gewebetyps zu erhalten?
- DNA-Methylierung analysieren
| - Methylierungsmuster der CpG-Inseln ist abhängig vom Zelltyp
87
Welches Methylierungsmuster bestizt die Zygote?
- Gar keins, dieses wird erst im Verlauf der Embryonalentwicklung gebildet
- DNA-Methylierungsmuster der Eltern wird zurückgesetzt
- einmal in Gametogenese und einmal in früher Embryonalentwicklung (Morula)
88
Beschreiben Sie den Methylierungsverlauf der frühen Embryonalentwicklung
Zu Beginn, 5mc Level von Eizelle und Sperium gleich
Paternal:
-5mc nimmt nach Befruchtung schnell ab, während 5hmc schnell zunimmt -> aktive Demethylierung durch TET-Enzyme
-5hmc nimmt dann langsam ab -> passiv durch Verdünnung über viele Zellteilungen
Maternal:
-5mc nimmt langsam ab. Ebenfalls passiv
- In Morula ist Methylierungslevel bei beiden am geringst ->Reseting erreicht
- Bei Bildung des Blastozyst nehmen bei beiden die 5mc und 5hmc Level gleichmäßig zu (Gewebe beginnt sich zu differenzieren)
89
Welches Methylierungsmuster liegt bei ICM (inner cell mass) vor?
- Zunahme von 5mc, H3K9Me2 (konstitutives Heterochromatin) und H3K27me3 (fakultatives Heterochromatin)
- > Gewebspezifische Inaktivierung von Genen
90
Was sind PGCs? Was ist an diesen besonders?
Primordial Germ Cells
- Zukünftige Gameten fürs adulte Alter bilden sich schon früh in Embryonalentwicklung
- keine Gewebespezifischen Marker, da 5mc und H3K9me2 abnimmt
- H3K27me3 und H3K4Me3 (aktive Promotoren) nehmen zu
- > dadurch Expression der Pluripotenzfaktoren
- Bivalente Zellen: Sowohl aktive als auch repressive Eigenschaften
- sind Pluripotent (können sich in alles differenzieren außer Placenta)
91
Was ist ICM und TE?
ICM: Inner Cell Mass
- Embryonale Stammzellen
- Für Ausdifferenzierung
- Bilden späteren Embryo
TE: Trophoektoderm
- schon etwas differenziert
- können nicht mehr zu ICM werden
- bilden später die Placenta
92
Was bedeutet Pluripotent, Multipotent, Totipotent und Unipotent?
Pluripotent:
- sind undiffernziert
- können alle Zelltypen eines Organismus bilden, bis auf Placenta
Totipotent:
- komplett undifferenziert
- können alles Zelltypen bilden, einschließlich der Placenta
Multipotent:
- Zellen einer bestimmten Zellline, die sich noch ausdifferenzieren können (z.B. bei Blutzellen, Immunsystem)
Unipotent:
- können nur einen Gewebetyp ausbilde
93
Was ist PGC Reprogrammierung?
- Frühe epigenetische Veränderungen von Keimzellen
- Aus Epiblast wird Gewebe bestimmt, das zu Keimzellen wird (Epiblast -> PGC -> EG = Embroyonale Keimzelle)
- aktive epigenetische und keimzellspezifsche Faktoren nehmen zu, während repressive Faktoren abnehmen
94
Was ist eine chimäre? Wie wird diese erzeugt?
- Mischung aus Zellen
- Entnahme von ESC (Embryonalen Stammzellen) aus Blastozyst und Manipulation
- Einsetzen eder maipluierten ESC in neuen Blastozyst
- > Integration in ICM
- differenzierte Zellen lassen sich nicht in ICM integrieren -> Pluripotenz geht verloren
- Im Verlauf der Entwicklung geht Pluripotenz verloren
95
Was ist SCNT?
Somatischer Zellkerntransfer
- Zellkern aus differenzierter Zelle in ent-kernte Eizelle
- > vollständiger Organismus
- Prinzip des Klonens
- Bei Fröschen und Dolly the Sheep erfolgreich
- habe allerdings sehr kurze Lebenszeiten
- Ineffizentes Verfahren, da zufällig ob Imprints richtig zurückgesetz werden
96
Was ist das Fetal overgrowth syndrom? Was sind Ursachen?
-klonierte Tiere kommen zu groß zur Welt, wachsen dann aber langsam
- Mütter sterben bei Geburt, wenn Kalb zu groß
Ursache: Vermutlich inkorrekte Histonmodifikation oder DNA-Methylierung bei imprinted Genen
97
Was ist induzierte Pluripotenz? Was sind Vorteile?
- auch SCNT Verfahren
Yamanaka:
- minimales Set von 4 Transkriptionsfaktoren (Yamanakafaktoren), die Pluripotenz der Zellen aus somatischen Zellen herstellen
- somit künstliche Erzeugung von Stammzellen aus differenzierten Zellen möglich
Vorteile:
- Nutztiere klonen für Landwirtschaft
- Medizinische Relevant: Klonen von Organen in Schweinen oder Insulinproduzierende Zellen
98
Was ist genomic Imprinting?
Genomische Prägung
- Paternale und maternale Gene werden trotz gleicher DNA Sequenz unterschiedliche stark exprimiert
- Nicht mit Mendel Genetik erklärbar
99
Nennen Sie ein Beispiel für genomic Imprinting
Bei Mäusen:
- IGF2 Gen (Wachstumsfaktor)
- Deletionsmutante igf2-/igf2-
- > Mäuse sind kleiner
- 2 Fälle, jeweils Heterozygot:
1) paternal WT, maternal Mutante
- > Maus groß
2) paternal Mutante, maternal WT
- > Maus klein
- -> Expression abhängig ob Allel von Vater oder Mutter stammt (paternales Alle ist also exprimierend genomisch geprägt, während maternales reprimierend genomisch geprägt ist)
100
Erläutern Sie ein Beispiel von genomic Imprinting im Detail
Bsp: Maus
- IGF2 Gen (insulin like growth factor = Wachstumsfaktor)
- H19: lncRNA
- ICR (imprinting control region)
- CTCF (bindet unmethylierte GC-reiche Sequenzen)
- Enhancer downstream von H19
paternal:
- ICR ist methyliert -> inhibiert H19
- Enhancer wirkt somit auf IGF2 gen
- > Expression
maternal:
- ICR ist unmethyliert -> CTCF bindet (Insulator) -> bildet Grenze
- > verhindert, dass Enhancer auf IGF2 wirkt
- Enhancer wirkt somit auf H19-Gen
- > Gen wird nicht exprimiert
101
Was sind charakteristika von genomic Imprinting?
- Mehrere Genorte
- Es gibt Proteinkodierende Gene, aber mindestens ein Gen für nicht-kodierende RNA
- Oft bei Embryonalentwicklung und Wachstumsfaktoren
102
Was lässt sich über Wachstumsfaktoren bei genomic Imprinting aussagen?
- Wenn Wachstumsfaktor fördernd, dann ist dieser tendenziell paternal exprimierend und maternal reprimierend
- Wenn Wachstumsfaktor hemmend, dann umgekehrt
Hypothese:
- Mutter will nicht, dass Embryo zu groß wird (Problem Riesenkälber; overgrowth syndrom)
- schädigt Uterus
- außerdem will Mutter Ressourcen auf alle Nachkommen gleich verteilen, daher sollten alle gleich groß sein
- Vater will möglichst große Nachkommen -> Besser fürs überleben
- > Konflikt der beiden Partein
103
Was ist Tropoblast defense?
Durch Imprinting wird verhindert, dass sich spontan in der Frau aus der Oozyste eine Embryo wird ohne Befruchtung
104
Welche Humane Krankheiten werden durch Imprinting Fehler ausgelöst?
1) Beckmann Widemann-Syndrom (BWS)
-Kleines Gehirn, große Zunge/Bauchnabel
-Missexpression von Igf2/H19
Grüunde:
- z.B. Hypermethylierung des maternalen Genoms
-> ICR methyliert -> CTCF bindet nicht mehr -> maternal wird auf Igf2 exprimiert
-oder paternale uniparentale Disomie (2 Chromosomen)
-oder Methylierungsfehler in ICR
-> zu viel Genprodukt
-In beiden Fällen zu viel Igf2
2) Silver Russel Syndrom (SRS)
-Gegenteil zu BWS
-Zu wenig Igf2
Grund:
-Paternales Gen defekt oder maternal 2 Allele
Bei den folgenden beiden:
- maternal methyliert, paternal demethyliert (umgekehrt zu Igf2)
- Nichtexpression der PWS- oder AS-Region führt hier zur Krankheit
- > Sind Reziprok zueinander, aber PWS maternale Überexpression und AS paternale Überexpression
3) Prader Willi Syndrom (PWS)
-Zu groß, Mentale Verzögerung
-Defektes Gen auf Chr. 15
Gründe:
-Maternale uniparentale Disomie
-Genkopie des Vaters defekt
-Gene von Vater nicht exprimiert, bei Mutter stillgelegt
-> Gene fehlen -> bestimmte Hormone nicht produziert
4) Angelmann-Syndrom (AS)
-Gegenteil von PWS
-Zu dünn, kognitive Behinderung, Hyperaktiv
-Auch Chr. 15, aber andere Region
-Gene von Mutter nicht exprimiert, bei Vater stillgelegt
Grund:
-Häufig Deletion von auf maternalen Chromosom
105
Nennen Sie Krankheiten, die auf Mutationen von Chromatinfaktoren beruhen.
- Rubinstein-Taybi-Syndrom (HAT)
- Rett-Syndrom (MeCP2)
- Immunschwäche, Zentromerische Instabilität (Dnmt3b)
106
Was lässt sich über die Epigenetik von Krebs aussagen?
- Globale Hypomethylierung (wenig)
- >genetische Instabilität
- lokale Hypermethylierung (viel)
- >insbesondere an Tumorrepressorgenen
- Epigenetik theoretisch umkehrbar (Therapie)
107
Was sind Epigenetische Medikamente? Was sind Probleme?
-DNMT Inhibitoren
(sind Nukleotidderivate, Einbau während Replikation, Binden Enzym kovalent und inaktiveren es somit)
-HDAC Inhibitoren
-HAT,HMT Inhibitoren
-Sirturin Inhibitoren (NAD+ abhängige HDAC)
-Bromodomaininhibitoren
Probleme:
- Spezifität und Selektivität
- >Inhibieren alles gleichermaßen -> sehr toxisch
- HDACs haben auch noch andere Proteine als Histone als Targets
- Mechanismus der Therapie unklar
108
Welche Regionen in S. cerevisiae (Bäckerhefe) sind vom Silencing betroffen?
- Paarungstypgene HML und HMR durch Heterochromatin
- Telomere durch Heterochromatin
- rDNA (durch SIR2)
- Von oben nach unten nimmt Robustheit/stärke des Silencing hab
- Heterochromatin verursacht, durch SIR2/SIR3/SIR4
109
Wie werden die Paarungstypgene in S. cerevisiae reprimiert?
- MAT-Lokus kodiert für Paarungstyp (a oder alpha)
- Haploide Zellen können sich nur mit entgegengesetzten Paarungstyp paaren
- HML und HMR Lokus wichtig für Paarungstypwechsel, sind aber ständig reprimiert (nur aktiv wenn Mating typ switch)
- Durch I und E Silencer an enden der Loki, wird Heterochromatin aufgebaut
- Heterochromatin gebildet durch SIR-Komplex
- MAT-Lokus besitzt keine Silencer, daher aktiv
- und E sind Bindestellen für Repressorproteine Rap1, Abf1 und ORC-Komplex
110
Was ist der Paarungstypwechsel in S. cerevisiae?
- MAT-Typ kann gewechselt werden, indem Information aus HML oder HMR importiert werden
- Doppelstrangbruch durch HO-Endonuklease
- Genkonversion und MAT-Typ wechsel (ähnlich zu genetischer Rekombination)
- Im Labor diese Endonuklease oft ausgeschaltet für stabilen haploiden Phänotyp
111
Wie erfolgt das Teleomerische Silencing in S. cerevisiae?
- Aufbau von Heterochromatin durch SIR-Komplex (hier nur SIR2/SIR3/SIR4)
- Ähnlich zu HML und HMR Loki (Silencer Regionen, Bindestellen für Repressorproteine)
112
Wie erfolgt das Silencing des ribosomalen DNA Lokus in S. cerevisiae?
- rDNA besteht aus vielen Repetetiven Sequenzen
- Nur SIR2 ist beteiligt, nicht SIR3/SIR4
- SIR2 sorgt für Repression des rDNA Lokus
- Teil von RENT Komplex
- bindet an Polymearse I (rRNA) und Replikationskapel um zu silencen
- wichtig, da Repetetive Sequenzen anfällig für Rekombination sind
- dies führt zu Alterung der Zellen
- Repression durch SIR2 verhindert die Rekombination
113
Welche Regionen werden bei S. pombe (Spalthefe) gesilenced?
- Zentromere
- Paarungstypgene mat2, mat3
- Telomere
- rDNA
S. pombe hat keinen SIR-Komplex!
114
Wie erfolgt das Zentromerische Silencing bei S. pombe? Wofür ist es wichtig?
- Besteht aus Zentraler Domain (Kinetochor) und outer Repeats (Heterochromatin)
- Outer Repeats sind invertiert
- >Wenn Transkription auftritt, bildet sich dsRNA durch komplementäre Basenpaarung der Transkripte
- dsRNA wird von Dicer fragmentiert
- RITS-Komplex nimmt dsRNA Fragmente auf (ähnlich zu RISC-Komplex)
- RITS-Komplex bindet an Zentromerische DNA und enthält Methyltransferase (H3K9Me)
- Methylierung sorgt für Bindung von Swi6, welches Region reprimiert
- ->Zyklen von wenig Transkription und keiner Transkription
- Heterochromatin wichtig für stabiles Zentromer und Chromosomensegretation
- Ähnliches Prinzip bei höheren Eukaryoten
115
Wie erfolgt das Silencing der Paarungstyp Gene bei S. pombe?
- Mat1 wird exprimiert
- Mat2 und Mat3 reprimiert
- Links und rechts von Mat2 und Mat3 sind inverted repeats (Wie beim Zentromerischen Silencing)
- Gesamter Bereich zwischen inverted repeats ist reprimiert
- Auch hier: Transkription der invertierten Repeats führt zur Bildung si-RNA, welche an RITS-Komplex bindet
- Methylierung (H3K9) und Repression des Gens (durch Swi6?)
116
Was versteht man unter Antigenischer Variation? Wo tritt diese auf?
- Tritt bei Parasiten auf (vorallem Plasmodium)
- besitzt 60 var-Gene, aber nur eins davon ist aktiv (Rest im subtelomerischen Bereich ->reprimiert)
- var-Gen kodiert für Oberflächenprotein
- diese werden vom Immunsystem erkannt
- Parasit kann zwischen den var-Genen zufällig wechseln, somit kann Immunsystem den Parasiten nicht effizient bekämpfen
- Epigenetische Therapie: Telomerisches Silencing aufheben ->alle Var-Gene exprimiert und können vom Immunsystem bekämpft werden
117
Welches Silencing tritt bei Neurospora crassa (roter Schimmelpilz) auf? Was ist die Besonderheit im Vergleich zu S. cerevisiae und S. pombe?
- Repeat-induced point mutation (RiP) in Meiose
- Quelling außerhalb der Meiose
- MSUD (meiotic silencing of unpaired DNA)
- >Schutzmechanismen
Besonderheit: Besitzt DNA-Methylierung
118
Was ist RiP? Wie funktioniert es?
Repeat-induced point mutation:
- Mischung aus genetischen und epigenetischen Mechanismen (Mutation + DNA-Methylierung)
- Duplizierte Sequenzen werden punktmutiert und methyliert -> reprimiert
- In Meiose unterschiedliche DNA Methylierung möglich
- >Schutz vor Transposons (nur bei sexueller Fortpflanzung)
119
Was ist Quelling?
- Multiple Sequenzen werden detektiert und reprimiert (bis zu 30%)
- Bei Herstellung von Transformanten, werden diese nicht stärker exprimiert sondern teilweise reprimiert
- Wenn Sequenzen transformiert die homolog zu nativer sind, dann wird native gesilenced
- siRNA vermittelt
- Evolutionärer Schutzmechanismus
120
Zusatz: Was passiert beim miotic silecing of unpaired DNA?
- Ungepaarte DNA in Meiose führt zum Tod
| - Wenn an beiden Stellen Allel fehlt, überlebt der Pilz
121
Was ist Quelling?
- Multiple Sequenzen werden detektiert und reprimiert (bis zu 30%)
- Bei Herstellung von Transformanten, werden diese nicht stärker exprimiert sondern teilweise reprimiert
- Wenn Sequenzen transformiert die homolog zu nativer sind, dann wird native gesilenced
122
Wie funktioniert (foward) genetic screening?
Bsp. Drosophila
- Nutze Balancer (B)-Chromosom:
- Rezessiv lethal
- Unterdrückt Rekombination
- Dominanter Marker (Phänotyp: Gebeugte Flügel)
F0: +/+ x +/B
-Homozygote Fliege wird mit EMS behandelt -> erzeugt zufällige Mutation
Mutation wird Isoliert und in F1 wieder mit +/B gekreuzt
F1: m/+ x +/B
Mutation fixiert
F2: m/B x m/B
F3:
25% B/B (stirbt, wegen Eigenschaften des Balancer-Chromosoms)
50% m/B
25% m/m
123
Wie funktioniert (foward) genetic screening?
Bsp. Drosophila
- Nutze Balancer (B)-Chromosom:
- Rezessiv lethal
- Unterdrückt Rekombination
- Dominanter Marker (Phänotyp: Gebeugte Flügel)
F0: +/+ x +/B
-Homozygote Fliege wird mit EMS behandelt -> erzeugt zufällige Mutation
Mutation wird Isoliert und in F1 wieder mit +/B gekreuzt
F1: m/+ x +/B
Mutation fixiert
F2: m/B x m/B
F3:
25% B/B (stirbt, wegen Eigenschaften des Balancer-Chromosoms)
50% m/B
25% m/m (screening nach interessanten Phänotypen)
-Herausfinden, welches Gen mutiert wurde
124
Was sind Hox Gene?
- Genprodukte sind Transkriptionsfaktoren mit Homeobox DNA Bindestellen
- wichtig für Segmentierung entlang des anterior-posterior Achse
- Entscheidende Regulatoren die eine Kaskade aktiviern die zur Bildung der Organe führt
- Sind in Funktion und Sequenz hoch konserviert
125
Was ist Homeotische Transformation?
Missexpression von Hox Genen in Körperregionen, inden sie sonst nicht wirken
- z.B. Fliege mit Beinen statt Antennen (Antennapedia Mutante) oder Bithorax Mutante mit 4 Flügen
126
Was ist das Zelluläre Gedächtnis?
- In früher Embryonalentwicklung werden Segmente festegelegt, indenen Hox Gene exprimiert werden
- PcG (Polycomb-group)-Proteine sorgen für Unterdrückung und TrxG (Trithorax group)-Proteine für Aktivierung der Expression der Segmente während der fortlaufenden Entwicklung
- Polycomb Proteine sind negativ Regulatoren
127
Was macht der PRC2-Komplex?
- Etabliert Silencing (X-Chromosom bei Frau)
| - Macht Methylierung (H3K27Me) und entfernt Acetylierung
128
Was macht der PRC1-Komplex?
Hält Repression über langen Zeitraum aufrecht
| -Inhibiert Chromatin remodeling, was zur Aktivierung des Chromatins führen würde
129
Wofür sind PcG DNA Bindeproteine wichtig in Drosophila?
| Welche Aufgaben übernehmen sie in anderen Organismen.
-Binden an DNA und rekrutieren PRC1 und PRC2, da diese selbst nicht an DNA binden können, aber für Repression wichtig sind
In anderen Organismen:
-Kontrollieren Zellwachstum/Zellteilung
-Beteiligt an X-Chromosominaktivierung
130
Was sind TrxG-Proteine?
(In Drosophila)
- Umgekehrte Wirkung wie PcG Proteine
- Sorgen für Genaktivierung durch ATP abhängiges Chromatinremodeling (Nucleosome sliding, eviction, histone exchange, structure alteration)
- Wirken Anti-reprimierend auf Chromatin
131
Welche Rolle übernehmen TrxG-Proteine in anderen Organismen?
Im Menschen sind viele Proto-onkogene oder Tumor-repressor
| -Mutation der TrxG Gene führt häufig zu Krebs
132
Was ist position effect variegation (PEV)? Wo tritt es auf?
- Auge von Drosophila (Weiß und Rot Mosaik)
- white Gene (macht Rotes Auge)
- Durch Inversion auf X-Chromosom in nähe von Heterochromatischer Strukutr
- Heterochromatin breitet sich bis zu dem white Gen aus-> inaktiviert dieses
- Nur in manchen Zellen inaktiviert, hier ist Auge dann weiß
133
Was lässt sich mittels mutagenesis screening über die Enhancer und Suppressoren von PEV aussagen?
PEV = position effect variegation
Mutation der Suppressoren:
-weniger Silencing -> Auge ist mehr rot
Mutation der Enhancer:
-weniger Aktivierung/mehr Silencing -> Auge mehr weiß
- ca. 150 Gene die am PEV Phänotyp beteiligt sind
134
Welche Funktion übernehmen Boundary/Insulator Elemente?
Bilden Schleifen des Chromains
- Zwei Möglichkeiten:
1) Bringen Enhancer und Gen zusammen. Schützen es vor Heterochromatin -> Aktivierung
2) Trennen Enhancer von Gen ->Inaktivierung
- Wichtig in TAD (Topologically associated domains), als Trennung von anderen Genen oder Heterochromatin (Segementierung der TADs)
- Wird hier durch CTCF-Protein vermittelt
- Fehlt dieses, kann Heterochromatin in Genbereich eindringen und es inaktivieren -> Krankheiten
-In einigen Geweben kann bestimmtes Protein binden um Boundary aufzuheben und somit z.B. zur Genaktivierung führen
135
Was ist Transvection?
- Enhancer oder Repressoren des einen Chromosoms können auf gleiche Allel des anderen Chromosoms wirken
- Nur effektiv bei räumlicher Nähe
136
Was ist Dosiskompensation?
- Mechansimus der zum Ausgleich der Genaktivität zwischen den Geschlechtern dient
- Basiert darauf, dass zwischen Geschlechtern, unterschiedliche Geschlechtschromsomen vorliegen mit unterschiedlichen Genen
-Unterschiedliche Gendosis wird schlecht von Organismus toleriert (z.B. Trisomie -> nicht gesund oder nicht lebensfähig)
137
Vergleichen Sie die Mechanismen der Dosiskompensation zwischen Säugern, Drosophila und C. elegans.
Säuger:
- Bei Weibchen, ein X-Chromosom inaktiviert (Barr-Körperchen)
- Passiert zufällig
Drosophila:
-Bei Männchen, Hyperaktivierung des X-Chromosoms -> doppelt so stark exprimiert
C. elegans:
- Bei Hermaphroditen beide X-Chromsome zur Hälfte runterreguliert
- 2 mal 0,5-fache Expression
138
Was ist die Lyon-Hypothese?
Bei Säugern:
- Inaktives X-Chromosom in Barr-Körperchen
- Anzahl der Barr-Körperchen ist immer um eins geringer als Anzahl der X-Chromosomen des Genotyps
- Unterschiedliche Anzahl der Gonosomen wird durch die X-Chromosomen Inaktivierung recht gut toleriert
XX -> 1 Barr-Körperchen
XY -> 0 Barr-Körperchen
XXY -> 1 Barr-Körperchen ("Kliefelter"-Syndrom ->Mann)
X0 -> 0 Barr-Körperchen ("Turner"-Syndrom ->Frau)
XXX -> 2 Barr-Körperchen (Frau)
XXXX -> 3 Barr-Körperchen (Frau)
139
Wo ist die stochastische Inaktivierung des X-Chromosoms sichtbar?
1) Calico-Cat
2) Mausfellfärbung
3) Frauen mit heterozygoter Mutation -> ändert Substrat im Schweiß
- Kann sichtbar gemacht werden
- Unterschiedliche Köperregionen gefärbt
- In allen Generationen unterschiedlich, da auch beim Mensch Inaktivierung zufällig
140
Was lässt sich allgemein über den Mechanismus der Dosiskompensation bei Säugern aussagen?
- Stochastischer Prozess (Zufällig, ob paternales oder maternales X-Chromosom inaktiviert wird)
- Einmal festgelegt, wird die Inaktivierung an alle Tochterzellen weiter vererbt (irreversibel)
- >Klonale Vererbung
- Flecken (z.B. beim Mensch oder Calico-Cat) sind unterschiedlich groß
- > Zeitpunkt der X-Chromosomen Inaktivierung in Embryonalentwicklung erfolgt in einem Zeitfenster und kein festen Zeitpunkt
- Wenn früh -> Fleck groß
- Wenn spät -> Fleck klein
141
Welche zwei Klassen von X-Chromsom Inaktivierung gibt es?
1) Random X-Chromosom Inaktivierung
- Zufällig in Embryonalentwicklung
2) Imprinted X-Chromosom Inaktivierung
- z.B. paternales X-Chromosom inaktiviert bei Beutelsäugetieren oder Plazenta der Maus
Hyptohese warum paternales:
- Konkurrenz der Genome
- Mutter könnte Paternales X-Chr als fremd empfinden
- Mutter Interesse an Regulation von Plazenta und Embryo
-In Keimzellen liegen X-Chromosome aktiv vor
142
Eläutern Sie den Mechanismus der X-Chromosom Inaktivierung bei Säugern. (Dosiskompensation)
- Ausbildung von Heterochromatin durch Xist (X inactive specific transcript)
- Gen welches lncRNA erzeugt
- Liegt im Xic (X inactivation center)
- Tsix = Revereses transkript zu Xist -> reguliert dieses
Mechanismus:
- Xist wird vom Chromosom selbst exprimiert
- Ein Chromsom exprimiert irgendwann mehr Xist -> dieses wird dann inaktiviert (Wirkung in cis)
- Xist springt auf Chromosom zuerst zu Entry sites
- Xist rekrutiert PRC2 -> H3K27Me (fakultatives Heterochromatin)
- etwas H3K9Me
- Deacetylierung
- Dann Rekrutierung von macro.H2A und DNA-Methylierung
- Xist breitet sich aufs ganze Chromosom auf und inaktivert dieses durch Rekrutierung von Faktoren die Repressive Modifikationen vornehmen
143
Was sind Escaper?
- Gene die der X-Chromosom Inaktiverung entgehen
- z.B. Xist -> somit wird permanent lncRNA erzeugt und Inaktivierung aufrecht erhalten
- Sitzt auf kurzem Arm des Chromosoms, dieser ist evolutionär betrachtet noch jung
144
Wie erfolgt die Dosiskompensation in Drosophila?
-Hyperaktivierung des männlichen X-Chromosoms
Dosiskompensationskomplex (DCC) besteht aus:
-MOF = HAT (MYST-Familie) ->Hyperacetyleriung von H4K16Ac
-MSL (male specific lethal; Bei Mutation nur in Männchen lethal)
-MSL1, MSL2, MSL3
MSL1: nicht bekannt
MSL2: H2B Ubiquitin-Ligase
MSL3: Chromodomän (bindet H3K36)
MLE: Helikase, bindet ssRNA
Mechanismus:
- Rox Gen wird transkribiert -> lncRNA
- diese bindet mit DCC an Entry Site
- DCC irgendwann auf ganzem Chromsom verteilt
- Durch HAT in DCC wird Chromsom verstärkt transkribiert
145
Was sind Gemeinsamkeiten und Unterschiede zwischen der Dosiskompensation in Säugern und Drosophila.
Gemeinsamkeiten:
- Bei beiden lncRNA die in cis wirken
- Gesamtes Chromosom erhält Chromatin-Marker
- Ausbreitung nicht homogen -> präferierte Bindstellen (Entry Sites)
Unterschiede:
-Bei Säugern Inaktivierung beim Weibchen bei Drosophila Hyperaktivierung beim Männchen
146
Wie erfolgt die Dosiskompensation in C. elegans?
2 mal 0,5-fache Expression bei Hermaphroditen (beide etwas dosiskompensiert)
- DCC ähnelt Kohäsin/Kondensin (aus Metaphase,Mitose)
- besteht aus globulärer Domain, coiled coil und hinge (Scharnier) ->Zeichnen
- Zwei Kodensin ähnliche Strukutren können sich an hinge Region zusammenlagern und Brückenproteine an globulärer Domain binden und somit Ring erzeugen
- DNA Schleife wird durch Ring geführt (X-Chromsom Spezifität)
- >leichte Kondensation
- >beide X-Chromosome etwas runterreguliert (0,5-fache)
147
Woraus besteht der DCC-Komplex in C. elegans? Zeichen Sie diesen.
- Kohäsin/Kondensin verwandte Struktur (globuläre Domain, coiled-coil, hinge)
- DPY-26 und DPY-28: Brückenproteine
- DPY-27: coiled-coil hinge ->bildet Schlaufe
- Mix1
- SDC1/SDC2/SDC3: binden an DNA
- DPY-30: Histonmethyltransferase
- DP21: Verbindet DNA-Bindekomplexe mit Kondensin
148
Was sind Gemeinsamkeiten und Unterschiede bei der Dosiskompensation von C. elegans und Säugern/Drosophila.
Gemeinsamkeit:
- Komplex der sich in cis ausbreitet
- gibt präferierte Bindungstellen
Unterschiede:
- keine ncRNA
- bei C. elegans keine Enzyme beteiligt
149
Was ist transgenerative epigenetische Vererbung? Was ist das generelle Dogma?
- Genetische Vererbung: Änderung in DNA-Sequenz in Keimbahnen werden vererbt
- Epigenetische Vererbung: Gibt es Vererbung von erworbnen Eigenschaften?
- Ja, z.B. Peloria-Mutante oder RNA-Interferenz bei C. elegans
Generelles Dogma: Vererbung ist bedingt durch DNA-Sequenz, bei Säugern keine 100%ig Sicherheit, ob epigenetisch Vererbung existiert
150
Vergleichen Sie Darwinismus und Larmackismus.
Darwin:
- Genetische Vererbung
- Evolution durch spontane/zufällige DNA Mutation
- Selektion
- Resetting der epigenetischen Eigenschaften in Meiose
Larmack:
-Vererbung erlenter Eigenschaften
Neo-Larmackismus:
-Wenn erworbene Eigenschaft günstig, ist es gut diese zu vererben
-> Ist aber falsch (z.B. Giraffe mit langem Hals)
151
Welche Experimente machte Lyssenko?
-Wollte Landwirtschaftliche Erträge steigern
-Getreide unter schlechten Bedingungen züchten
-Dieses muss sich anpassen
-Vererbt Anpassung dann weiter
->Falsch (Hatte positiv Effekt durch Roggen vom Nachbarfeld)
(-Führte zu Ernteausfällen und Hunger)
152
Welche Experimente machte Kammerer?
Geburtshelfergröte:
- Leben regulär an Land
- Durch Hitze ins Wasser gezwungen
- Bildeten Brunftschwielen an Vorderpfoten
- Wurde bis in 7te Generation weitervererbt, auch wenn Frösche wieder an Land lebten
- War aber Fake. (Tinte in Vorderpfote gespritzt)
Salamander:
- Züchtung auf farbigen Untergrund
- Änderten Farbe
- Farbe vererbt
- Durch Krieg Experimente verloren gegangen
- Nicht nachgeprüft, da zeitaufwendig und unwahrscheinlich
153
Nennen Sie Beispiele für transgenerative epigenetische Vererbung die wissenschaftlich gut belegt sind.
1) RNA-Interferenz in C. elegans
- Würmer gefüttert mit Bakterien die dsRNA enhalten, die Gen inaktiveren soll
- Gen wird gesilenced
- Auch an Nachkommen vererbt, die mit dsRNA nicht im Kontakt waren
- Effekt nimmt über die Generationen ab
- Menge der dsDNA erklärt nicht Menge in F1-Generation, da Amplifikation durch RdRP (RNA dependent RNA Polymerase)
2) Peloria Mutante
- Eigentlicht Spiegelsymmetrisch
- Durch Veränderung in Methyleriungsmuster entsteht Radialsymmetrie
- DNA (Lcyc Gen) ist stärker methyliert
- DNA-Sequenz unverändert
- >Meiotische Vererbung der Methylierung seit über 250 Jahren
3) Paramutation in Mais
-Gen B: Verantwortlich für Antocyan-Synthese->dunkel lila Farbe
-Wenn Gen B mutiert -> Pflanze Grün
-Drei verschiedene Allele von Gen B:
B-I (Intense): paramutierbar ->Funktionsfähig->Pflanze lila
B': Paramutagen: Funktionsverlust ->Pflanze hell
B'X B-I: Phänotyp von B'. Pflanze hell lila
-Alle Allele sind genetisch identisch, aber in Gen nähe liegen Enhancer -> Imprints (epigenetische Markierung) an Enhancer können durch Paramutation an anderes Allel weitergeben werden (somit bei Rückkreuzung alle hell)
154
Warum funktioniert epigenetische Vererbung bei Pflanzen besser?
- Besitzen viele Homologe des gleichen Enzyms
- Andere genetische Toleranz
- Nicht alle epigenetischen Markierungen werden bei Pflanzen in Meiose gelöscht
155
Wie wird paramutation in Mäusen nachgewiesen?
- Kit = Rezeptor Tyrosin Kinase
- Allel: Kit ^(W-LacZ) :Insertion von LacZ als Reportergen
- Homozygot = Lethal
- Heterozygot = Weiße Pfoten und Schwanzspitze, verursacht durch Reportergen
- Rückkreuzung zu WT: Haben immernoch weißen Phänotyp und genetische zwei WT Allele
- >Paramutaion: Im Heterozygoten Zustand hat das mutierte Allel Einfluss auf WT Allel
- Eigenschaft nun vererblich
156
Welche Studien zur epigenetischen Vererbung gibt es beim Menschen?
Nicht wirklich klar, ob es das beim Menschen gibt!
1) Mutter (1. Gen.) raucht -> Auswirkung auf Baby (2. Gen.) -> da primodial germ cells (Keimzellen) schon früh in Embryonalentwicklung auch Auswirkung auf Baby des Babys (3. Gen.)
- Eigentlich keine transgenerative Vererbung, da 3. Gen. auch im Kontakt mit Rauch war (würde erst aber 4ter Gen. zählen)
2) Dutch Hunger Winter (1944-1945)
- Nahrungsmittelknappheit in diesem Jahr durch deutsche Besatzung
- > Auswirkung auf Babies bei schwangeren Frauen
- Kinder kleiner und erhöhtes Risiko für Kardio-Vaskuläre-Erkrankungen, Diabets, Übergewicht
- > Kinder haben im Mutterleib mitgehungert
- Enkelkinder zeigen verringerten Effekt, aber erhötes Risiko (Studie schwierig auszuwerten)
3) Överkalix-Studie
- Mortalitätsrisiko von Personen die Anfang des 20. Jhr. geboren
- Abschätzung wie gut Eltern und Großeltern gegessen haben
- Sehr ungenau und fragliche Studie
157
Warum spricht man von "You are what your dad ate"?
Bei Mäusen:
- Wenn Vater kalorienreich gefüttert oder im Mutterleib gehungert hat und mit normal gefütterten Weibchen gepaart
- >Töchter erhöhtes Risiko für Diabetes und Übergewicht (geringfügiger Effekt)
158
Wieviel Prozent des menschlichen Genoms codieren für Proteine?
2-3%
| Restlichen 97-98% für Regulation
159
Was lässt sich über die epigenetische Regulation aussagen?
- Gene sind nicht sortiert
- Topologie des Gens (TAD) sorgt dafür, dass regulatorische Elemente in Nähe des Gens sind (3D Anordnung)
- Genregulation ändert sich auch mit Tag/Nach Rhythmus
- Enhancer können auf mehrere Promotoren/Gene wirken
- Promotoren beeinflussen sich auch gegenseitig
160
Wie sind die Chromosomenterritorien konserviert?
- Bei gleichen Zelltypen unterschiedlicher Spezien ähnlich
- Bei unterschiedlichen Zelltypen einer Spezies, sind die Chromosomenterritorien unterschiedlich (Chromatinkontakte ändern sich)
161
Wie entstehen epigenetische Krankheiten?
-Durch Mutation in Genexpression
-Häufigste Ursachen für Krankheiten
-Mutationen in nicht kodierender DNA schwer zu verstehen (komplexe Chromosomenterritorien)
Bsp:
Mutation in einem Nukleotid im Enhancer der 1 MBase von Gen entfernt ist, sorgt dafür, dass Kind 6 Finger hat
162
Welche Methoden gibt es um Aufschlüsse über Chromosomenterritorien zu erhalten?
- DNA-FISH (Fluorescent in situ hybridization)
- Chromosome conformation capture (3C)
- 4C
- 5C
- Hi-C
- GAM (genome architecture mapping)
- SPRIT
- ChIA-Drop
163
Wie funktioniert DNA-FISH?
DNA Flourescent in situ hybridization:
- nutzt komplementäre Fluoreszenzmarker
1) Zellen fixieren (Crosslinken)
2) Marker Designen (DNA oder RNA) mit Flurophor
3) Denaturierung der DNA und Hybridisierung des Marker, Rest auswaschen
4) Auswertung:
- Wenn Fluoreszenzsignal -> keine Mutation, da Hybridisierung erfolgreich (aber Duplikation möglich, dann Signal doppelt so stark)
- Wenn kein Fluoreszenzsignal -> Mutation, da Hybridisierung nicht erfolgreich und Marker ausgewaschen
- -> Chromosomale Veränderungen feststellbar (Krankheiten)
164
Wie funktioniert GAM?
Genome Architecture mapping:
1) DNA fixieren und Cryosektion
2) Laser macht dünne schnitte durch Zellkern
3) Sequenzierung der Schnitte
4) Wenn zwei Regionen im 3D Raum nah beieinander, sind sie auch häufiger in einem Schnittsegment
165
Wie funktioniert SPRITE?
(Split-pool recognition of interactions by tag extension )
1) Fixierung, Kern Isolation, Zellkernaufschluss, DNAse Verdau
2) Fragmentiertes Chromatin wird aufgesteilt und erhält einen Barcode
3) Fragmente werden wieder gemixed, anschließend separiert und bekommen wieder Barcode
4) Sequenzierung. Alle Fragmente mit gleicher Abfolge von Barcodes, waren ursprünglich räumlich nah aneinander
166
Wie funktioniert ChIA-Drop?
(Chromatin- interaction analysis via droplet-based and barcode- linked sequencing )
1) Fixierung, Kern Isolation, Zellkernaufschluss, DNAse Verdau
2) Chromatinfragmente werden in Tröpfchen mit Barcodes aufgenommen
3) Auftrennung in Mikrofluidik Geräte (nach größe der Fragmente?)
4) Sequenzierung
5) Auswertung: Barcodes zeigen, welche Fragmente in gleichen Tröpfchen warn und somit räumlich nah beieinander
167
Warum ist Saccharomyes cerevisiae gut als Modellorganismus geeignet?
- Kurze Generationszeit (90 min)
- Leichte Handhabung und genetische Manipulation
- Wächst haploid
- Nicht Phatogen
- Ist ein Eukaryot
- 16 Chromosomen
- 1996 vollständig sequenziert
- Genomgröße 1,4*10^7 Basenpaare
- 2 Matingtypen MATa und MATalpha
168
Warum ist Caenorhabditis elegans gut als Modellorgansimus geeignet?
-Reproduktionszeit von 3 Tagen
-300-1000 Nachkommen pro Tier
-Hauptnahrungsquelle sind Bakterien
-Möglichkeit des Einfrierens
-ca. 1mm lang (unter Mikroskop gut sichtbar)
-Eutelie (immer gleiche Anzahl an Zellen)
-1998 komplett sequenziert
-Hermaphroditismus:
Männer X0
Hermaphroditen XX
169
Was ist die Schmelzkurvenanalyse und wofür wird diese genutzt?
- Bei qPCR kann nicht zwischen verschiedenen PCR-Produkten unterschieden werden
- Daher Schmelzkurvenanalyse:
- liefert Aufschluss über verschiedene DNA-Sequenzen oder Fragmentgrößen
- Nach der PCR wird Temperatur erhöht (von 50°C auf 95°C)
- DNA Stränge werden aufgeschmolzen
- Fluoreszenzmarken werden freigelassen
- Fluoreszenzsignal nimmt ab
- Plot von der Ableitung des Floureszenzsignals (dF/dT) gegen die Temperatur
- Entstehende Peaks sind charakteristisch fürs PCR Produkt
170
Wie funktioniert RNAi? Wofür kann es in der Wissenschaft verwendet werden?
RNA Interferenz:
1) dsRNA wird aufgenommen (z.B. über Nahrung)
2) dsRNA wird durch DICER fragmentiert
3) Argonaut Protein bindet die siRNA und entfernt "sense" Strang
4) Argonaut Protein + "Antisense" Strang + weitere Proteine bilden RISC-Komplex (RNA induced silencing complex)
5) durch komplementäre Basepaarung der Antisense RNA an mRNA wird Translation inhibiert (geblockt oder mRNA geschnitten)
Anwendung:
-Funktion eines Gens rausfinden, indem komplementäre dsRNA vom Organismus aufgenommen wird
-Gen wird gesilenced
-Wenn Gen ein Phänotyp hat ändert sich dieser
-Funktion des Gens erkannt ohne Mutant zu erzeugen
(Wir hatten unc-22 in C. elegans)
171
Welche Typen von ncRNAs gibt es?
Nicht-kodierende RNAs:
Silencing:
1) miRNA (micro RNA): bildet hairpin loops
2) siRNA (small interfering RNA /silencing RNA): aus dsDNA -> Dicer -> Argonaut -> RISC Komplex. Wesentlich spezifischer als miRNA
3) piRNA (piwi-interacting RNA): post- transkriptionelles silencing von Transposons und anderen repetetiven Sequenzen
4) snRNA (small nuclear RNA): zusammen mit Proteinen -> snRNPs -> Spliceosom
5) snoRNA (small nucleolar RNA): wichtig für chemische Modifikation von rRNA, tRNA und snRNA
6) lncRNA (long non-coding RNA): über 200 Nukleotide. Bsp: Xist oder rox bei Dosiskompensation oder HOTAIR bei Hox Genen
Epigenetik
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