Estudo de interações DNA-proteína Flashcards
Caracterização de interações proteína DNA genética:
- Determinação da sequência nucleotídica da região a que a proteína se liga e identificação de alterações na sequência que conferem um fenótipo mutado.
- Identificação de mutantes na proteína que afectam a sua capacidade de ligação ao DNA.
Caracterização de interações proteína-DNA bioquímica:
- Identificação de contactos potenciais entre proteína e DNA usando uma variedade de experiências de footprinting e protecção, tais como DNaseI ou footprinting com radicais hidroxilo, e experiencias protecção por metilação ou etilação.
Caracterização de interações proteína-DNA física:
- Análise de interacções específicas na sequência alvo da proteína por uso de co-cristais
Exemplos de ensaios para estudo de interações proteína-DNA in vitro:
- Gel Mobility Assay
- DNase I footprinting
Ordem decrescente de velocidades de migração no gel shift assay
DNA livre (não ligado a proteínas) → DNA ligado a uma proteína → DNA com proteínas em 2 sítios de ligação
O gel shift assay permite calcular:
Constantes de dissociação da proteína ao DNA
Refinamentos do gel mobility assay:
- presença de misturas complexas de proteínas, de modo a determinar qual a proteína que se liga ao fragmento de DNA
- ensaio “supershift”
- experimentos de competição
Método e objetivo do refinamento “supershift”:
Extratos celulares de diferentes tecidos → é usado um anticorpo para a proteína de interesse → DNA ligado à proteína e anticorpo tem uma velocidade de migração menor do que DNA apenas ligado à proteína → identificar em que tecidos se localiza a proteína de interesse
Objetivo de ensaios de competição em gel mobility:
Verificar se uma mutação no DNA/proteína afeta a afinidade da proteína para a sequência de DNA
Mecanismo de ensaios de competição em gel mobility:
Dois fragmentos de DNA diferentes colocados no poço, em que um está marcado (versão WT) e o outro não (mutado) → análise de resultados:
* proteína ligou se aos dois DNA → banda aparece mais aténue do que só com o DNA normal → mutação não influencia a ligação da proteína
* proteína apenas se liga ao DNA normal → banda aparece com uma maior intensidade → mutação afeta a ligação da proteína
* proteína liga-se apenas ao mutado → banda desaparece → mutação confere uma preferência da proteína pelo DNA mutado em relação ao não mutado
Objetivo do ensaio DNaseI footprinting:
Mapear com precisão a localização no DNA onde se liga a proteína
Mecanismo de DNaseI footprinting:
Marca-se a cadeia com o operator site (com p32) → Tratamento leve (quantidades baixas) com DNaseI de forma a que haja apenas um nick (quebra de cadeia simples) por fragmento → A DNase I cliva de forma aleatória e assim formam-se fragmentos de diferentes tamanhos → num gel desnaturante forma-se um ladder de bandas e cada banda difere apenas em 1 nucleotídeo → com a proteína ligada ao DNA, a DNaseI não consegue clivar o DNA nessa zona → bandas desaparecem nos nucleotídeos ocupados com a ligação à proteína → determina-se os limites de ligação e o operator site
Método in vivo para determinação de sítios de ligação de proteínas em células vivas:
Imunoprecipitação de cromatina (ChIP)
Procedimento de ChIP:
Formaldeído vai provocar cross link das proteínas ao DNA e de proteínas a outras proteínas → lise das células → DNA é clivado em diferentes fragmentos (200 a 300 bp) por sonicação → adiciona-se um anticorpo específico para a proteína de interesse → separação por imunoprecipitação dos fragmentos onde a proteína se liga → quantificar a interação por PCR (ou pode ser diretamente sujeito a sequenciação do DNA e, posteriormente, mapeia-se no genoma)
