Exam final Flashcards
(93 cards)
Les protéines extraites via différents types de purification de protéines doivent elles toujours être pure?
par nécessairement, certaines purification vont seulement avoir comme objectif de concentrer un maximum la protéine
Que recherche-t-on comme principale qualité d’une purification d’enzyme?
une activité enzymatique. la pureté est secondaire et d’autres protéines vont souvent être ajouté pour stabiliser l’enzyme.
quels critères permettent de séparer des protéines l’unes des autres?
la taille La solubilité La charge La densité L'hydrophobicité des marqueurs ajoutés immunogénicité
Comment peut on séparer une protéine d’un mélange à l’aide de sa taille?
une filtration
Quelle technique peut on utiliser pour séparer une protéine par sa solubilité
Précipitation aux sels
Quelle technique peut on utiliser pour séparer une protéine par sa charge
Chromatographie d’échange d’ions
Quelle technique peut on utiliser pour séparer une protéine par la densité
Sédimentation
Quelle technique peut on utiliser pour séparer une protéine par son hydrophobicité
Chromatographie en phase inverse
Quelle technique peut on utiliser pour séparer une protéine par des marqueurs ajoutés à celle-ci
chromatographie d’affinité
Quelle technique peut on utiliser pour séparer une protéine par son immunogénicité
par immunoprécipitation
en quoi consiste des marqueurs ajoutés à des protéines, des tag.
quelles protéines peut on purifier gràce à ces tag?
une séquence d’Acide aminé particulière qui a une énorme affinité pour une résine ou un anticorps spécifique
Ces séquences peuvent être ajouté par génie génétique à des protéines à exprimer puis les protéines recombinantes peuvent être purifiées.
pourquoi ne pourrait on pas utiliser seulement les méthodes de purification protéiques les plus efficaces pour sortir une protéine d’un extrait cellulaire?
Certaines techniques coutent cher, ou sont simplement impossible à faire sur un extrait cellulaire crude à cause des composantes cellulaires comme les membranes/l’ADN
quelles critères recherche-t-on dans une méthode de purification de protéines?
sensibilité: capable d’isoler une protéine très diluée
Spécificité: ne ramasse pas la mauvaise protéine
réactifs disponibles
Coût faible
Court temps
à quelle longueur d’onde les protéines absorbent ils la lumière UV?
les aromatiques absorbent à 280nm
La liaison peptidique absorbe à 190-200nm
pourquoi n’utilise pas toujours la longueur d’onde du lien peptidique lorsqu’on cherche à suivre une protéine dans un protocole de purification?
les tampons utilisés dans des extractions absorbent aussi à des longueur d’ondes proche de 200nm.
C’est aussi une méthode très générale qui ne permet pas de suivre une protéine particulière.
quel acide aminée est massivement lié par le bleu de coomassie lors d’essais de colorimétrie protéique?
l’arginine. d’autre acides aminés sont liés de facon moins importante
Comment fonctionne la colorimétrie au bleu de coomassie?
Le colorant est jaune lorsqu’il est libre mais bleu quand il se lie à des acides aminés.
Lorsqu’on cherche à sourcer des protéines, y a t’il certaines limitations à la production in-vitro de n’importe quelle protéine?
Les protéines chez les eucaryotes plus complexes ont souvent des modifications post-traductionnelles. Si l’on cherche à faire exprimer ces protéines dans des procaryotes, les modifications PT vont être différentes.
Il y a aussi d’autres facteurs comme le repliement de la protéine qui peut poser des problèmes.
comment des inhibiteurs de polymérase peuvent ils être utilisé pour favoriser l’expression d’une protéine dans des procaryotes? (rifampicine comme exemple)
La rifampicine inhibe la polymérase endogène à E.coli
On peut modifier des bactéries pour qu’elles expriment des polymérases virales, qui ne reconaissent que les promoteurs viraux
On peut donc ajouter le gène de la protéine à exprimer sous promoteur viral.
En inhibant la polymérase endogène, il ne restera que la polymérase virale qui est spécifique au promoteur du gène de la protéine à exprimer.
pourquoi les extractions de protéines sont plus efficaces dans une chambre froide?
dans l’extrait cellulaire, il y a des protéases et des enzymes lysosomales qui fonctionnent à la température optimale pour la cellule
Le froid inhibe les réaction de ces enzymes
comment peut on inhiber l’activité des enzymes lysosomales et les protéases lors de purifications de protéines?
faire l’Extraction dans une chambre froide
Utiliser un tampon qui a un pH peu optimal pour l’enzyme
Les protéases peuvent aussi être inhibé par des molécules chimiques, des inhibiteurs de protéases)
pourquoi doit on ajouter des agents réducteurs à un mélande de purification de protéine?
l’atmosphère est beaucoup plus oxydant que l’intérieur d’une cellule, ce qui pourrait endommager les protéines
comment fonctionnent des homogénéisateurs Dounce et Potter. quelle est la différence entre ces deux homogénéisateurs et quelle est leur fonction?
ils servent à briser des cellules de facon mécanique pour éviter d’endommager d’autres composantes cellulaires comme les noyaux.
Ce sont des tubes où on dépose les cellules et où un insère un piston qui va briser les cellules. des pistons plus serrés avec la paroi du tube peuvent briser les noyaux alors que d’autres laissent les noyaux intact
Le piston dounce est un ‘‘UP and DOWN’’
Le piston Potter est attaché à un moteur rotatif.
comment fonctionne la presse aminco-French et à quoi sert-elle?
à lyser des cellules.
Elle est composé d’une potence qui va faire descendre un piston dans une chambre pressurisé.
Pour lyser les cellules, on indroduit les cellules à lyser dans la chambre pressurisée lorsque le piston est levé, on ferme la valve de sortie et on actionne le piston pour compresser le liquide
Cela fait augmenter la pression énormément dans la chambre. On ouvre ensuite la vis lorsque la pression est à son maximum pour relâcher un jet de lysat cellulaire.
