exam théo 1

Question 1

C’est quoi des nucléases? Font quoi comme activité? viennent d’ou et leur rôle initial.

Answer 1

-enzymes qui digèrent liens phosphodiesters selon une séquence spécifique reconnue
- B,
- rôle de protection contre virus

Question 2

Les sites de reconnaissance des ENZr sont longs comment?. Quel type de séquence c’est?

Answer 2

1. 4 à 16 nu
2. palindrome : séquence identique de 5’ à 3’ sur les deux brins complémentaires

Question 3

Quels sont les 3 types de clivage d’ENZr? comprendre ça donne quoi

Answer 3

1. bouts francs: coupe en plein milieu de séquence. dépasse pas

2.1 bouts collants extrémité 5’ : coupe deux places diff, dépasse par extremité 5’

2.2 bouts collants extrémité 3’ : …

Question 4

Lors de sous-clonage, pourquoi on a avantage à utiliser des ENZr brins collants? (2)

Answer 4

1. localisation pour former molécule recombinante va se faire plus facilement, moins énergie. Meilleur rendement.
2. maximise spécificité de ligation

Question 5

ligases d’ADN font quoi?, sur quels types de clivage on peut faire ? Ligase la plus utilisée?

Answer 5

1. rcatalysent réparation liens entre phosphate et hydroxyle (5’ et 3’ )
2. sur bouts francs et collants mais collants si nu les deux brins sont complémentaires

3, ligase t4 venant phages

Question 6

EcoRI: quel type clivage, vient quelle B, reconnsiy quelle séquence, on peut-tu relier avec ligase?

Answer 6

1. bouts collants 5’
2. E.coli, première ENZr
3. GAATTC
4. oui

Question 7

Quelle est la charge d’un G phosphate quand: sol alcaline? sol neutre:

Answer 7

alca: - (normalement dans cell)

neutre : neutre

Question 8

Expliquer le fct d’une ADN phosphatase et dans le concept d’un sous-clonage. Quand est-ce qu’on fait cette étape?

Answer 8

1. enlève G phosphate du 5’
2. empêche vecteur accepteur de se refermer et d’être religué par ligase
3. on fait étape avant insérer insert si on a utilisé juste UNE ENZr

Question 9

Comment on fait pour ajouter insert si on a utilisé une ADN phosphatase. Comment ça marche

Answer 9

1. L’insert lui a des G phosphates, donc liaison par ligase sur juste un seul brin à chaque site de coupure (2/4)
2. recircularisation par possbile
3. réparation complète et liaison complète une fois insert dans cellule hôte.

Question 10

que signigie le terme sous-clonage

Answer 10

Former une nouvelle constru moléculaire en mettant un insert d’un vecteur qui le contenait déjà à un autre qui est vide mais mieux adapté.

Question 11

C quoi un ADN recombinant. C quoi un plasmide chimère

Answer 11

Dès que ADN étranger ajouté dans ADN.
On amplifie dans B pour X ADN qu’on a

chimère: Plasmide recombinant

Question 12

C quoi le clonage

Answer 12

ensemble des étapes nécessaires à la prod d’un molécule d’ADN recombinant.

Question 13

quelles sont les 2 utilités principales du clonage moléculaire

Answer 13

1. analyser role fragment ADN/gène
2. biotech: produire en grande quantité une prot recombinante (insuline)

Question 14

décrire les plasmides: comment se répliquent, leru forme, taille, mêmes gènes que ADN Xome? combien de copies? rôles

Answer 14

1. répliquent aux-mêmes avec ORI
2. circulaire 2x brin
3. k- 10k pB
4. non, gènes diff
5. plusieurs copies par B
6. prolif, R, survit milieux diff

Question 15

Quelles sont les composantes d’un vecteur de clonage (3)

Answer 15

1. ORI: réplication autonome du plasmide
2. Marquer de sélection (gène R antibio)

3.SCM: séquence ADN 100 nu ajouter articfiellment au vecteur où on met l’insert

Question 16

Diff entre sélection et criblage. SCM FAIT PARTIE DE QYOI?

Answer 16

Sélection: place B dans milieu sélectif (voit celles qui on intègre plasmide)

Criblage: on Check après quelles B expriment une construction plasmidique (par LacZ/Xgal dans le SCM)

Question 17

La B galactosidase est formée de? Décrire comment on s’en sert pour crublsge sélection bleu blanc

Answer 17

2 sous unités: LACz oméga ( dans ADN chromo) et lacZ alpha (qu’on ajoute avec insert)

Active expression par IPTG. On met subrast (x-gal). Faut bleu si présence de B-galacto=

Bleu = pas d’insert dans plasmide

Question 18

Pour le criblage, quelle info il manque à savoir après la sélection bleu-blanc? Comment on fait?

Answer 18

Si l’insert est dans le bon sens

On met gène de GFP dans insert,

Si bon sens= production de GFP et donc visible

Question 19

Quelles sont les 2 composantes du criblage vleu-blanc

Answer 19

Génomique: LacZ Omega

Plasmidique; LacZ alpha

Question 20

Les B E.coli ont été trafiqués pour retiré le leur gène LacZ alpha chromosomique pour pas qu’elles produisent B-galactof

Question 21

à quoi sert le tampon de chargement et fait de quoi

Answer 21

fait de glycérol et colorants.

Mélange à échantillon pour le rendre dense et visible. Diminue diffusion dans reste du gel.

Question 22

Le voltage et la durée de migration sont déterminés en fct de ? (2)

Answer 22

1. taille/conformation
2. concentration agarose

Question 23

agarose est, sert à?

Answer 23

un polymère de sucre

faire des gels pour analyser ADN (purifier/séparer, déterminer taille de fragments ou ADN)

Question 24

la migration d’ADN sur gel dépend donc de ? (2)

Answer 24

taille et conformation

Question 25

quelles sont les 3 formes possibles d'ADN plasmidiques? qui qui migre le plus vitee

Answer 25

1. circulaire superenroulé: forme naturelle, migre le plus vite 2. circulaire relâché: cassure d,Un des brins. moins compact= le plus lent 3. ADN linéaire: lorsque ADN coupé deux brins au même endroit (enzymes). Le deuxième plus vite

Question 26

PLus les fragments à séparer sont longs et lâches, plus il faut une... C d'agarose. le contraire esrt vrua pour de petits fragments compacts.

Answer 26

petite C pour gros Grande concentration pour petitus

Question 27

À quoi sert le tampon de migration (2), il contient quoi?

Answer 27

1. contient ions pour permettre passer courant 2. permet pH basique pour PO4- ADN soit négatif et que çâ migre vers pole + Contiennent du EDTA et du TBE (tris-borate)

Question 28

à quoi sert EDTA dans tampon migr et le TBE?

Answer 28

EDTA: agent chélateur, inhibe activité DNases TBE: tampon, conserve pH base et conditions ioniques pour courant

Question 29

Comment on fait pour visualiser l'ADN migré après? (2)

Answer 29

1. SYBRsafe: lie à ADN :fluo si UV 2. EtBr: agent intercalant: fluo si UV

Question 30

PK on utilise E.coli pour études?

Answer 30

Peu chère facilement modifiable font pas de méthylation ADN reprod rapide culture facile peu pathogènes

Question 31

Quelles sont les 2 caractéristiques importantes de E.coli DH5a LacIq?

Answer 31

1. ADN chromosomique a pas LacZ alpha 2. LacI ( répresseur de LacZ) est toujours induit = LacIq. Permet de contrôler par IPTG quand produit B-gala

Question 32

IPTG agit dur quoi et comment?

Answer 32

se lie au répresseur LacIq et l'empehce de se lier de bloquer le promoteur.

Question 33

Décrire une stratégie de digestion ENZr pour déterminer quelles B ont insert dnas le bon sens (si t'As pas mis GFP mettons)

Answer 33

1. choisir 2 sites de restriction qui sont pas utilisés déjà 2. ils doivent couper une seule fois dan insert et l'Autre une fois dans vecteur 3, doit pas couper en plein milieu de insert 4. tu calcules la distance nete les deux coupures, les fragments après migration devrairnt avoir la longueur attendue, et pas l"Autre qui correspond ç mauvais sens.