Examen 2 Flashcards
(155 cards)
Comment peut-on identifier un clone spécifique à notre gène d’intérêt?
- Cribler la banque d’ADN génomique ou d’ADNc à l’Aide de sonde spécifique
QUel type de molécule peut reconnaitre une sonde?
- ADN
- Protéines
Quel type de blot est utilisé pour l’ADN, l’ARN et les protéines?
ADN : southern
ARN : Northern
Prot. : western
Grâce à quoi peut-on dénaturer des brins d’ADN?
- Chaleur
- OH-
Qu’est-ce que la stringence?
Décrit la sévérité des conditions sous lesquelles une hybridation est effectuée
Comment augmenter la stringence?
- Baisser les concentrations en sels et augmenter la température
Que permet d’augmenter la stringence?
- Permet de s’assurer que la sonde ne s’accroche pas n’importe où
- Permet l’appariement de séquences très similaires uniquement
DE quoi sont composé les sondes d’ADN?
Oligonucléotides homologues à la séquence du gène recherché
Comment est obtenu une sonde?
- Fragment d’ADN cloné du gène chez la même espèce à l’étude ou chez un autre espèce
- ADNc cloné qui sert de gabarit pour une sonde d’ARN
Avec quoi est marqué une sonde?
32P-dCTP ou à l’aide d’un nucléotide DIG-11-dUTP
Qu’est-ce que le digoxigenin?
Nucléotide qui contient un morceau supplémentaire lui permettant de faire une reconnaissance à l’aide d’anticorps
QUel type de marquage de sonde peut être effectué?
- Luminescence
- Fluorescence
- Colorimétrique
À quoi sert la pré-hybridation?
- Permet de saturer notre membrane d’ADN exogène pour que la sode puisse uniquement se coller à l’ADNc
À quoi servent les agents dénaturants dans la pré-hybridation?
- Formalmide, formaldéhyde
- Permettent d’empêcher les fragments d’ADN de s’attacher ensemble
Qu’est-ce que la luciférase?
Enzyme qui permet la lumière chez les lucioles
Elle dégrade la luciférine ce qui produit de la lumière
Qu’est-ce que le random primed labeling?
Technique utilisée pour marquer des fragments d’ADN avec des molécules radioactives ou des molécules fluorescentes
Comment fonctionne le random primed labeling?
- Les molécules d’ADN sont dénaturées
- Des amorces composés de 6 nucléotides différents
- La polymérase ajoute des nucléotides normaux et des dUTP marqués une fois de temps en temps
Que permet le random primed labeling?
- Identifier des séquences d’ADN spécifiques
- Créer des sondes d’ADN marqués
Quel est le principe du marquage par PCR?
On met les ingrédients normaux pour une PCR mais certain des nucléotides sont marqués (dUTP)
On amplifie et on obtient des molécules d’ADN marqués
Quel est le principe de la Nick translation?
- La DNase 1 va faire des coupure dans les brins d’ADN
- La polymérase va retirer un nucléotide pour le remplacer par un dUTP marqué
Quel est le principe du marquage en 3’ avec ajout d’environ 50 nucléotides?
La terminal-transférase ajoute des nucléotides marqués et non marqués pour former une queue poly-A
Quel est le principe du marquage en 3’ unique?
La terminal-transférase rajoute un seul nucléotide (dddUTP -) pas de OH)pour permettre de limiter les faux positif
Qu’est-ce que le marquage par sondes d’ARN?
- Utilise un plasmide avec un promoteur T7 devant la séquence d’intérêt
- ARNpolymérase synthétise un ARN messager avec des dUTP
Quelles sont les 2 méthodes de détection à la suite de l’hybridation de la sonde marquée avec la DIG?
- Cheluminescence ou réaction colorimétrique
- Fluorescence