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Examen final - Bio > Examen 2 > Flashcards

Examen 2 Flashcards

(78 cards)

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1
Q

Protéine de fusion

A

Protéine recombinante qui inclut la protéine d’intérêt + une étiquette (ex. GST). Facilite la purification ou la détection.

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2
Q

E. coli BL21

A

Souche d’Escherichia coli utilisée pour la production de protéines (expression), avec moins de protéases et adaptée à la surexpression.

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3
Q

Promoteur tac

A

Promoteur inductible dérivé de l’opéron lac, contrôlé par le répresseur lacI, activé par l’IPTG. Il permet la transcription du gène d’intérêt en protéine lorsqu’il n’est pas empêché par lacI.

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4
Q

Protéine recombinante

A

Protéine produite par un organisme dont le matériel génétique a été modifié (ex. introduction d’un plasmide).

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5
Q

IPTG (isopropyl β-D-thiogalactopyranoside)

A

Inducteur analogue du lactose, se lie au répresseur lacI et autorise la transcription du gène sous le promoteur tac. Non hydrolysé par les bactéries.

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6
Q

Lysat cellulaire

A

Extrait contenant l’ensemble des protéines et constituants libérés après la rupture (lyse) des cellules.

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7
Q

Sonication

A

Technique (ultrasons) pour briser les parois bactériennes et libérer le contenu cellulaire.

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8
Q

Lysozyme

A

Enzyme qui dégrade la paroi des bactéries, facilitant la lyse.

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9
Q

Triton X-100

A

Détergent non ionique utilisé qui augmente l’efficacité de la lyse (il augmenterait aussi la solubilité des protéines).

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10
Q

Chromatographie d’affinité

A

Méthode de purification exploitant une interaction spécifique (ex. GST ↔ glutathion).

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11
Q

Glutathion

A

Tripeptide (Glu-Cys-Gly) auquel la GST se lie fortement, permettant la purification sur colonne.

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12
Q

Billes Sepharose-glutathion

A

Support de chromatographie d’affinité : le glutathion est fixé sur des billes de Sepharose, retenant la GST ou GST-RecP1.

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13
Q

Dosage protéique (ex. Bio-Rad)

A

Technique colorimétrique mesurant la concentration en protéines. On compare l’absorbance à une courbe standard (ex. BSA).

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14
Q

BSA (Bovine Serum Albumin)

A

Protéine standard servant à établir la courbe de calibration lors du dosage (méthode Bradford ou DC Protein Assay).

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15
Q

Facteur de dilution

A

Le nombre par lequel on multiplie la concentration lue pour retrouver la concentration réelle de l’échantillon (ex. x10 si dilution 1/10).

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16
Q

SDS-PAGE

A

Électrophorèse sur gel d’acrylamide en présence de SDS, séparant les protéines selon leur masse moléculaire.

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17
Q

Gel d’acrylamide

A

Support vertical utilisé en SDS-PAGE, plus fin que l’agarose, adapté à la séparation des protéines.

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18
Q

Stacking gel

A

Couche supérieure du gel d’acrylamide (faible %), qui concentre les protéines en une bande avant la séparation.

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19
Q

Running gel (gel séparateur)

A

Couche inférieure du gel d’acrylamide (plus fort %), où s’effectue la séparation réelle des protéines selon leur taille.

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20
Q

β-mercaptoéthanol

A

Agent réducteur (ou DTT) qui rompt les ponts disulfure dans les protéines, assurant leur dénaturation.

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21
Q

Marqueur de poids moléculaire (protein ladder)

A

Mélange de protéines de tailles connues, servant de référence pour estimer la masse (kDa) des protéines analysées.

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22
Q

Western Blot (immunobuvardage)

A

Technique qui transfère les protéines depuis un gel SDS-PAGE sur une membrane, puis les détecte via des anticorps spécifiques.

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23
Q

Anticorps primaire (Ac¹)

A

Anticorps reconnaissant spécifiquement la protéine d’intérêt (ex. anti-GST).

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24
Q

Anticorps secondaire (Ac²)

A

Anticorps dirigé contre l’anticorps primaire, couplé à une enzyme (HRP…), permettant la révélation colorimétrique/lumineuse.

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25
Flow through
Fraction qui ne s’est pas fixée sur la colonne de chromatographie (sans affinité).
26
Cadre de lecture (in frame)
Manière de lire les triplets (codons). L’ADNc de RecP1 doit s’insérer dans le même cadre que GST pour produire la protéine fusion correcte.
27
Extrait total « non induit »
Échantillon provenant de bactéries sans IPTG, produisant peu ou pas de protéine recombinante.
28
Extrait total « induit »
Échantillon provenant de bactéries traitées à l’IPTG, manifestant une forte expression de GST ou GST-RecP1.
29
Fusion GST-RecP1
Protéine hybride ~50 kDa formée par GST (25 kDa) et RecP1 (25 kDa) en cadre de lecture continu.
30
Opéron lac
Régule l’expression de gènes impliqués dans la digestion du lactose (ex. lacZ). Le promoteur tac en est dérivé.
31
Clivage (ex. par la thrombine)
Action de séparer l’étiquette GST de la protéine RecP1, si besoin, après la purification.
32
Transcription
Processus par lequel l’ARN polymérase synthétise un ARNm à partir d’un gène (promoteur → ARNm).
33
Traduction
Assemblage des acides aminés en protéine par les ribosomes, à partir de l’ARNm (début au codon START, fin au codon STOP).
34
Promoteur
Séquence d’ADN où l’ARN polymérase se fixe pour initier la transcription d’un gène.
35
pGEX vs pGEX-RecP1
pGEX : plasmide produisant la protéine GST seule (~25 kDa). pGEX-RecP1 : plasmide produisant la protéine de fusion GST-RecP1 (~50 kDa).
36
Où et pourquoi ajoute-t-on l’ADNc de RecP1 ?
Dans le site de clonage multiple (SCM) du plasmide pGEX, en phase (in frame) après le gène GST, pour produire GST-RecP1.
37
Quelle souche utilise-t-on pour produire les protéines ?
*E. coli* BL21, car elle est adaptée à l’expression de protéines (moins de protéases, etc.).
38
Quel est le principe du promoteur tac ?
C’est un promoteur dérivé de l’opéron lac, réprimé par lacI, activable par l’IPTG.
39
Pourquoi l’IPTG n’est-il pas consommé par la bactérie ?
Parce qu’il est non hydrolysable, à la différence du lactose. Sa concentration reste donc stable.
40
Quand ajoute-t-on l’IPTG ?
Généralement en fin de phase exponentielle (OD600 ~ 0,6–1,0) pour maximiser la biomasse et la production de protéines.
41
Pourquoi ne pas induire trop tôt ni trop tard ?
Trop tôt : la bactérie pourrait être affaiblie (toxicité, moins de croissance). Trop tard : la culture vieillit, la division et le rendement diminuent.
42
Comment récupère-t-on les protéines après l’induction ?
On récolte les bactéries par centrifugation, puis on lyse (sonication, lysozyme, Triton) pour obtenir un lysat cellulaire.
43
Quelle est la différence E. coli DH5α vs BL21 ?
DH5α : clonage (usine à plasmides). BL21 : expression (usine à protéines).
44
Pourquoi la protéine recombinante peut-elle être toxique pour la bactérie ?
Parce que la surexpression mobilise beaucoup de ressources, ou que la protéine produite perturbe les fonctions cellulaires.
45
Quel est l’intérêt d’avoir muté certaines endonucléases et protéases ?
Pour éviter la dégradation du plasmide (endonucléases) ou de la protéine (protéases) et améliorer la stabilité de l’expression.
46
À quoi sert la chromatographie d’affinité ?
À purifier une protéine d’intérêt grâce à une interaction spécifique (ex. GST ↔ glutathion).
47
Quelles sont les étapes principales de la chromatographie d’affinité ?
1) Binding (liaison) sur colonne, 2) Lavage (washing), 3) Élution (avec du glutathion libre).
48
Comment détermine-t-on la concentration de protéine purifiée ?
On réalise un dosage colorimétrique (ex. Bio-Rad), en comparant l’absorbance à une courbe standard (BSA).
49
Pourquoi faire des dilutions multiples lors du dosage ?
Pour s’assurer que l’absorbance mesurée reste dans la gamme linéaire de la courbe standard.
50
Comment calcule-t-on la concentration finale ?
On reporte l’absorbance sur la courbe (y=mx+b), puis on multiplie par le facteur de dilution.
51
Quelle masse la GST fait-elle environ ?
GST seule pèse environ 25 kDa. La fusion GST-RecP1 fait ~50 kDa.
52
Que se passerait-il si on n’ajoute pas de glutathion libre en phase d’élution ?
La protéine GST (ou GST-RecP1) resterait fixée sur la colonne, car aucune compétition pour libérer la protéine.
53
Pourquoi la GST est-elle un bon tag de purification ?
Elle est relativement stable, améliore parfois la solubilité de la protéine, et interagit très spécifiquement avec le glutathion (affinité forte).
54
Pourquoi ne pas utiliser un gel d’agarose pour les protéines ?
Car l’agarose est trop grossier ; on préfère l’acrylamide (SDS-PAGE) pour séparer des protéines de plus petite taille.
55
Qu’apporte le SDS aux protéines ?
Il les dénature et leur confère une charge négative uniforme, de sorte qu’elles se séparent par masse moléculaire.
56
Comment lit-on un gel SDS-PAGE ?
On compare la distance de migration à un marqueur de poids moléculaire, et on observe la présence/absence de bandes.
57
Comment confirme-t-on l’identité d’une bande sur le gel ?
Par Western Blot : on transfère sur membrane et on utilise un anticorps spécifique (anticorps primaire), puis secondaire pour la révélation.
58
Que signifie une bande unique dans la fraction purifiée ?
Que la protéine d’intérêt est très majoritaire/pure, sans contamination significative.
59
Quel est l’intérêt du Western Blot ?
Confirmer qu’une bande donnée est bien la protéine recombinante (ex. GST-RecP1) via un anticorps spécifique.
60
Quelles sont les étapes du Western Blot ?
1) Transfert (des protéines du gel SDS-PAGE vers une membrane en nitrocellulose ou PVDF), 2) Blocage (avec du lait ou de la BSA pour empêcher les fixations non spécifiques), 3) Anticorps primaire (reconnaît spécifiquement la protéine d’intérêt), 4) Anticorps secondaire + enzyme (reconnaît l’anticorps primaire et est couplé à une enzyme comme HRP), 5) Détection (par ajout d’un substrat colorimétrique ou chimiluminescent qui révèle la présence de la protéine ciblée).
61
Exemple de contrôles en SDS-PAGE ?
- pGEX sans IPTG : pas de bande 25 kDa\n- pGEX avec IPTG : bande ~25 kDa\n- pGEX-RecP1 avec IPTG : bande ~50 kDa.
62
Comment agit la β-mercaptoéthanol ?
Elle réduit les ponts disulfure (S-S), aidant la dénaturation complète des protéines avant SDS-PAGE.
63
Quel est le rôle du stacking gel ?
Rassembler/concentrer les protéines en une seule bande avant leur entrée dans le gel de séparation (running gel).
64
Pourquoi colorer le gel SDS-PAGE (bleu de Coomassie) ?
Pour visualiser les bandes de protéines après la migration, déterminer la pureté et estimer leur taille.
65
Pourquoi est-il crucial de respecter le cadre de lecture lors de l'insertion d'un ADN dans un plasmide ?
Cela garantit qu'un seul ARN est transcrit – et donc qu'un unique ARNm sera produit et traduit – évitant ainsi la transcription ou la traduction de segments distincts qui conduiraient à la production de plusieurs protéines.
66
Qu'entend-on par un promoteur constitutif ?
Un promoteur constitutif est un promoteur qui est constamment actif, contrairement à un promoteur inductible. Comme AmpR et LacIq ## Footnote Par exemple, les promoteurs du gène AmpR et de LacI fonctionnent en permanence.
67
Quel est l'objectif d'un promoteur inductible ?
Un promoteur inductible permet de choisir précisément le moment de l'activation de la production de la protéine d'intérêt, par exemple en l'induisant à la fin de la phase exponentielle de croissance.
68
Quelle autre protéine est produite par le vecteur pGEX ?
Le vecteur pGEX produit également la protéine LacI.
69
Que signifient les expressions « en amont » et « en aval » ?
« En amont » signifie avant un point de référence donné, tandis que « en aval » signifie après ce point de référence.
70
Qu'est-ce que LacI et comment fonctionne-t-elle ?
Le gène LacI, situé en amont du promoteur tac, code pour un répresseur qui se lie à l'opérateur et inhibe l'expression du promoteur tac, empêchant ainsi la transcription tant qu'un inducteur n'est pas présent.
71
Pourquoi un opéron lactose est-il présent chez E. coli ?
Pour permettre à la bactérie d’utiliser le lactose comme source d’énergie, mais on ne crée pas de protéine si la bactérie n’Est pas dans le lactose, pour ne pas gaspiller d'énergie (raison pourquoi on utiliser un promoteur inductible)
72
Quelles sont les quatre phases de la courbe de croissance des bactéries ?
La phase de latence (adaptation, division lente), la phase de croissance exponentielle (division active), la phase stationnaire (équilibre entre division et mortalité) et la phase de déclin (mortalité supérieure à la division).
73
Pourquoi est-il important de doser les protéines avant de procéder à une analyse sur gel d'acrylamide ?
Le dosage permet de déposer une quantité précise de protéines dans chaque puits. Une quantité insuffisante rendra les bandes peu visibles, tandis qu'une quantité excessive conduira à des bandes surchargées et mal définies.
74
Qu'est-ce que le réactif Bio-Rad Protein Assay ?
Il s'agit d'un réactif colorimétrique qui réagit avec certains acides aminés, produisant une couleur bleue dont l'intensité est proportionnelle à la concentration en protéines.
75
Pourquoi a-t-on directement utilisé un gel d'acrylamide en laboratoire ?
L'acrylamide en poudre étant neurotoxique, l'utilisation directe d'un gel préalablement préparé permet d'éviter les risques liés à sa manipulation.
76
Pourquoi faut-il dénaturer les protéines avant de les séparer sur gel SDS-PAGE ?
La dénaturation élimine la structure tridimensionnelle des protéines, les rendant linéaires afin que leur migration sur le gel soit exclusivement fonction de leur masse moléculaire.
77
À quoi sert le tampon Laemmli 4X lors du chargement des échantillons ?
Ce tampon augmente la densité de l'échantillon protéique (similaire au rôle du glycérol) et contient un colorant bleu qui permet de suivre la progression de la migration sur gel.
78
Que représentent les multiples bandes observées sur un gel SDS-PAGE ?
Elles correspondent aux différentes protéines naturellement produites par les bactéries, en plus de la protéine d'intérêt.

Examen final - Bio (3 decks)

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