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Biologie moléculaire > Examen 2 > Flashcards

Examen 2 Flashcards

(135 cards)

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1
Q

V/F

Il est impossible d’effectuer le marquage d’une sonde à l’aide de la DIG-11-dUTP sans la présence d’une ADN polymérase.

A

FAUX

ex : terminale transferase et ARN polymérase

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2
Q

V/F
Le gène tk utilisé dans la construction du vecteur d’expression pour la fabrication d’une souris «knock-out» sert à conférer une sensibilité à un antiviral ce qui permet la destruction des cellules ayant incorporé ce gène.

A

VRAI
Donne la sensibilité au ganciclovir (antiviral)
* Sans tk = rien
analogue de base phosphorylé (par tk) est incorporé et arrête la polymérisation

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3
Q

V/F

Le SYBR Green est une molécule intercalante qui sert à visualiser l’ADN lorsque excitée avec une lumière UV

A

VRAI

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4
Q

V/F

Le marquage d’une sonde à l’aide de la DIG-11-UTP est plus spécifique que le marquage radioactif à l’aide du 32P-dCTP

A

FAUX
Il y en a un de radioactif et l’autre fluo (2 drapeaux)
*pas de différence de spécificité… c’est un nucléotide comme un autre

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5
Q

V/F

Lors d’une électrophorèse, l’ADN et les protéines migrent toujours du pôle négatif vers le pôle positif.

A

VRAI

*ADN et protéines chargés positivement

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6
Q

V/F

Les RFLP n’ont généralement aucune fonction biologique

A

VRAI
Juste un endroit dans le génome (marqueur moléculaire) qu’on trouve/utilise - qui donne un portrait génétique d’une famille.

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7
Q

Au cours de la fabrication d’une souris transgénique «knock-out»

a) il y a 3 possibilités du devenir de notre vecteur étranger dans le génome de la cellule souche
b) toutes les cellules de la souris transénique «knock-out» seront transformées à la suite de la réintroduction des cellules souches dans le bouton embryonnaire du blastocyste
c) la recombinaison homologue n’est pas nécessaire puisque l’ADN étranger peut s’insérer de façon non spécifique et aléatoire dans le génome de l’hôte
d) les souris chimères sont toutes homozygotes

A

A

on cherche la recombinaison homologue - c’est ce que l’on sélectionne

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8
Q

Combien faut-il d’amorce(s) d’ADN différentes pour effectuer l’amplification d’un fragment d’ADN par la méthode du PCR ?

A

2

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9
Q

Dans la solution de préhybridation au cours de la méthode de Southern ou Northern lequel de ingrédient ci-dessous est absent ?

a) ADN exogène en excès tel que l’ADN de sperme de saumon
b) des sels
c) des agents dénaturants comme la formamide/formaldéhyde
d) des sondes d’ADN marquées
e) toutes ces réponses

A

D

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10
Q

Dans la thérapie germinale :

a) on injecte un transgène dans un oeuf fécondé
b) une cellule transgénique est injectée dans un embryon au stade blastocyste
c) le transgène injecté se retrouve dans toutes les cellules de l’animal transgénique
d) l’animal transgénique produit est une chimère composée de cellules non-transgéniques et transgénique

A

B et D

thérapie germinale = directement dans l’ovule

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11
Q

Expliquer comment faire le marquage d’une sonde en 3’ pour qu’il y ait ajout d’un seul nucléotide

A

ddNTP - nucléotide didéoxy (méthode de Sanger)
-OH absent
terminal transférase

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12
Q

Combien de nucléotides minimaux une sonde doit être pour être complémentaire à 100% seulement 1 fois dans l’ADN ?

A

20 nucléo

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13
Q

Pourquoi chauffe t-on l’ADN ?

A

Pour le dénaturer - le rendre simple-brin

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14
Q

Comment fixe-t-on l’ADN pour l’empêcher de se réhybrider après qu’il est été chauffé ?

A

Fixation aux UV *peut causer des mutations (crosslinked)

Ou choc termique (bain glace)

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15
Q

Qu’est-ce que la stringence ?

A

Permet de réguler l’hybridation - augmenté ou réduire complémentarité non totale (homologie)

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16
Q

Qu’est-ce qu’un faux positif ?

A

Hybridation d’une sonde avec de l’ADN avec moins de 100% d’homologie

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17
Q

Est-ce qu’une concentration saline élevée aide l’hybridation d’ADN ?

A

OUI

aime solution saline - SSC

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18
Q

Comment fait-on pour empêcher la fixation des ADN à la membrane ?

A

Bloquage par ADN exogène dans la solution de pré-hybridation

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19
Q

Pourquoi utilise-t-on le sperme de saumon ?

A

Peu coûteux
Accessible
pour bloquer la membrane

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20
Q

au niveau de l’origine (ATGC) des nucléotides, qu’est-ce qui peut influencer une forte hybridation ?

A

% GC (3 liens) = donne solidité = plus dur de séparer les 2 brins

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21
Q

comment augmente-t-on la stringence ?

A

baisse concentration saline

augmentation de la température

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22
Q

Qu’est-ce que fait une diminution de la stringence ?

A

plus de faux positif

aide sonde à s’hybrider (même avec moins d’homologie)

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23
Q

Pourquoi utiliserait-on une diminution de stringence ?

A

Quand on cherche des gènes humains qui ressemblent à des gènes trouvés dans un autre organisme

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24
Q

Qu’est-ce que du DIG-11-UTP ?

A

Drapeau sur chaque U ou T

*dioxygénine reconnue par un anticorps

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25
Quel indicateur est plus stable entre le DIG-11-UTP et le 32P-dCTP ?
DIG-11-UTP
26
Quelles sont les étapes pour cloner un gène ?
1. Dénaturer (95°C) - devient simple-brin 2. Fixation (UV ou choc thermique) 3. Hybridation amorce (64°C) 4. Ajout ADN polymérase - polymérisation à partir de la sonde(marquage aléatoire)
27
Que fait la Nick translation DNase ?
Fait des trous que l'ADNpoly vient bouché à partir des sondes *finit pas son travail
28
Comment peut-on ajouté un seul nucléotide ?
ddNTP : -3' OH de supprimé (arrêt synthèse - un seul DIG)
29
Est-ce qu'un seul nucléotide (ddNTP) est suffisant pour voir le signal ?
OUI
30
Quel gel utilise-t-on pour recevoir l'ADN pour établir la séquence nucléotidique par électrophorèse ?
Gel d'acrylamide (précis au nucléotide près)
31
Qu'est-ce que la méthode de Sanger ?
Électrophorèse avec 4 puits (ATGC) et ddNTP qui ont arrêté la séquence à différentes places (diff longueur de bout de gène - aléatoire)
32
Qu'est-ce que le polymorphisme ?
Différence dans la séquence d'ADN du même locus dans deux organismes
33
Qu'est-ce que le pyroséquençage ?
Ajout de nucléotide un par un et émission de lumière qui apparaît quand le nucléotide est ajouté = on mesure la lumière émise
34
À quoi sert le pyroséquençage ?
Déterminer la séquence d'ADN
35
Dans le pyroséquençage, qu'est-ce qui fournit l'énergie pour l'émission de lumière ?
Libération de 2 Phosphates quand il y a liaison à l'ADN
36
Quelles sont les étapes du PCR ?
- Dénaturation (94°C) - Annealing/hybridation amorces (55-65°C) - Polymérisation (72°C)
37
À quoi servent les adapteurs à bouts francs qu'on colle aux bouts de l'ADN ?
Reconnaissance pour mettre amorce
38
Qu'est-ce que Q-PCR ?
PCR quantitatif
39
Qu'est-ce que TaqMan ?
Une amorce de plus (au milieu de l'ADN) = permet d'être quantitatif *reconnait une séquence à l'intérieur de notre ADN 1 molé d'ADN= 1 molé de lumière
40
Qu'est-ce que le pyroséquençage ?
Mettre ATGC un par un > lumière qui apparait quand le nucléotide est ajouté = on mesure la lumière émise
41
Quelle enzyme convertit l'IPP est l'APS en ATP dans le pyroséquencage ?
ATP sulfurylase
42
Qu'est-ce que l'APS ?
adénosine 5' phosphosulfate
43
Que fait la luciférase ?
Prend l'ATP et convertit luciférine en lumière
44
Que devient la luciférine une fois clivée par la luciférase ?
oxyluciferine
45
Par quoi la lumière est détectée dans le pyroséquancage ?
CCD - caméra couplée
46
V/F | La hauteur des pics sur un pyrogramme est proportionnel au nombre de nucléotides incorporés
VRAI
47
Que fait l'apyrase ?
Dégrade les nucléotide et l'ATP ( fin de la méthode du pyroséquencage)
48
Avec quoi est incorporé l'ADN d'intérêt (brin) dans la première étape du pyroséquençage ?
ADN polymérase + ATP sulfurylase + luciférase + APS + luciférine + amorce de séquencage
49
Qu'est-ce que l'ATP sulfurylase ?
enzyme convertit l'IPP est l'APS en ATP dans le pyroséquencage
50
Comment nomme-t-on la méthode de marquage avec des amorces aléatoires qui déclenche la polymérisation par l'ADNpoly?
Random primed labeling
51
Est-ce que la séquence d'ADN à besoin d'être connu dans le random primed labeling?
NON | *on veut juste polymériser
52
Est-ce que l'amorce est connu dans le marquage PCR ?
OUI
53
Par quelle enzyme se fait la polymérisation dans le marquage PCR?
TAQpolymérase | *résistante à la chaleur
54
Quel méthode de marquage utilise la DNase ?
Nick translation | *fait trous
55
Quel méthode de marquage utilise l'ADNpoly ?
Random primed labeling
56
Quelle est l'enzyme utilisée dans le marquage en 3' avec ajout de 50 nucléotide ?
Terminale transferase
57
À quelle extrémité il y a un marquage unique avec ddNTP ?
3' | ** par terminale transferase
58
Quelle méthode de marquage utilise l'ARN?
Sonde d'ARN
59
Quel est l'avantage de la sonde d'ARN comme marquage ?
Déjà simple-brin (vu que c'est de l'ARN) | > plasmide linéarisé
60
Nommer les trois méthode de détection après l'hybridation
- Cheluminescence - Colorimétrie - Fluorescence
61
Quels sont les avantages du pyroséquencage ?
+ rapide besoin d'une seule copie (pas d'amplification) permet de lire une + longue chaine
62
Qu'est-ce que la CAS9?
Nucléase | *enlève le gène de façon ++ précise
63
Nommez les 3 étapes du PCR (amplification/amorce)
1- dénaturation de l'ADN (95°C) pour séparer les brins 2- hybridation des 2 amorces (55-65°C) 3- Polymérisation (72°C)
64
Si l'on ne connait pas la séquence de l'ADN à amplifier par PCR, comment fait-on pour que les amorces puissent s'y coller ?
Utilisation d'adaptateurs à bouts francs (qu'on connait la séquence) collés à l'ADN qui vont se faire reconnaitre par les amorces
65
Que fait-on pour éliminer les «premiers» brins de longueurs différentes dans la PCR (non-spécifique qui a été amplifier) ?
Augmentation de la stringence
66
V/F | à chaque cycle de la PCR, la lumière captée augmente
VRAI
67
Est-ce que le real-time PCR est un Q-PCR ?
OUI
68
Qu'est-ce que le RT PCR ?
Reverse transcriptase PCR (pour savoir si un gène est + ou - exprimé)
69
La courbe d'analyse du RT PCR sera plus haute ou plus basse si le gène analyse est plus exprimé ?
Plus haute
70
Qu'est-ce que le TAQman ?
Une amorce de plus - permet d'être quantitatif (3 amorces en tout) > reconnait une séquence à l'intérieur du gène
71
Qu'est-ce que signifique une seule bande sur électrophorèse après digestion par une enzyme ?
Que c'était un plasmide
72
Qu'est-ce qu'un RFLP ?
Toute modification des séquences d'ADN (mutation, addition, délétion) qui réorganise les sites de restriction. Lors de l'action d'enzymes de restriction, la taille des fragments de restriction est alors modifiée : on observe un polymorphisme
73
Est-ce que les RFLP ont une fonction biologique ?
NON
74
Qu'est-ce qu'un locus ?
Un endroit sur le chromosome (donc 2 copies)
75
Dans l'étude des RFLP, faut-il tenir compte des exceptions dû à la recombinaison homologue ?
OUI
76
Quelle est l'enzyme utilisé pendant la PCR ?
Taq polymérase
77
Qu'est-ce que la génétique classique ?
Partir du phénotype pour trouver un gène
78
Qu'est-ce que la génétique inverse ?
Créer une mutation (ou knock-out) dans un gène pour savoir à quoi il sert (son phénotype)
79
Partir du phénotype pour trouver un gène est de la génétique classique ou inverse ?
Classique
80
Comment fait-on un knock-out ?
Délétion complète du gène ou insertion d'un «drapeau» qu'on peut tracer dans le gène > ce qui l'inactive en même temps
81
Qu'est-ce que l'IPTG?
ON/OFF qui active le gène du ligand du récepteur T7
82
Qu'est-ce qui arrive s'il n'y a pas d'IPTG lors d'une production de protéine ?
Devient toxique pour la division cellulaire | * ON/OFF qui permet la régulation de production
83
À quoi sert un peptide signal lors de la production d'une protéine ?
Mettre TAG spécifique pour reconnaître la protéine p/r aux autres (ou la faire sortir de la bact)
84
Comment fait-on pour avoir un clonage «orienté»
Utilisation de 2 enzymes de restriction (pour l'orientation du gène)
85
Qu'est-ce que le système RISC ?
Interfère avec des doubles-brins d'ARN reconnus et les séparent
86
Quels sont les avantages de l'utilisation de phages pour un insertion de gène (dans de l'ADN) ?
- Permet le transfert d'ADN dans des cell eucaryotes | - Insertion dans le génome (par perdu lors de la division cellulaire) = + stable
87
Quel est le problème général de la thérapie génique ?
Ce ne sont pas toutes les cellules qui sont infectées
88
Quelle est la meilleure méthode pour l'insertion d'ADN dans un génome ?
Infection virale (phages)
89
Quel est la difficulté des BAC ?
C'est gros = difficile de réplication
90
Que fait-on pour réduire au maximum la taille de l'ADN qu'on insert ?
On réduit le promoteur à sa taille minimale (juste région fonctionnelle)
91
Nommez un exemple de gène rapporteur
- GFP | - promoteur de choc thermique (ex: avec beta-gal)
92
Qu'est-ce qu'un promoteur constitutif ?
Exprimé/actif dans toutes les cellules
93
Qu'est-ce que le gène tk ?
Pour la sélection | *thymisine kinase (ajout P à la thymine)
94
Qu'est-ce que la technologie TET-ON ?
ON/OFF utilisé par la levure | **prot s'attache sur le promoteur juste quand elle lie la doxycycline
95
Est-ce qu'il y a des télomères dans le Yeast artificial chromosome ?
OUI
96
Comment fait-on pour déterminer la section régulatrice d'un promoteur ?
Manipulation de sa région régulatrice (par délétion) in vitro
97
Quels sont les organismes les plus utilisés pour le génie génétique ?
Caenorhabditis elegans, drosophile et souris
98
Quelles sont les 3 possibilités d'insertion d'un gène ?
1. Rien - pas d'insertion 2. Insertion mais pas à la bonne place 3. Recombinaison homologue (insertion à la bonne place)
99
Comment sépare-t-on les génomes qui ont inséré l'ADN d'intérêt de ceux qui ne l'ont pas fait ?
Insertion préalable d'un gène de résistance à un antibiotique avec l'ADN qu'on à inséré > quand on met l'antibiotique en contact = juste ceux qui ont insérés l'ADN d'intérêt résisteront
100
Comment sépare-t-on les génomes qui ont inséré l'ADN d'intérêt à la bonne place *recombinaison homologue* de ceux qui ne l'ont pas fait ?
Insertion de TK (thymine kinase qui phosphoryle) aux extrémité - et inséré dans le génome par la polymérase (vont rester sur le gène original lors de la recombinaison homologue = absent sur les cellules qui auront inséré l'ADN correctement) > Ajout de Ganciclovir (antiviral) > Ganciclovir = inactif si non phosphorylé par TK donc seulement les cellules ayant du TK vont être tuées par le ganciclovir
101
Qu'est-ce que du Ganciclovir ?
Un antiviral
102
Dans quoi sont insérés les cellules qui ont résisté aux ganciclovir et à l'antibiotique ? (qui ont inséré le gène correctement par recombinaison homologue)
Dans le bouton embryonnaire
103
Comment appelle-t-on l'insertion d'un gène dans un génome ?
Transfection
104
Qu'est-ce que CRE ?
Enzyme (recombinase) qui excise l'ADN entre les locus loxP
105
Comment fait -on pour être capable d'avoir un embryon viable avec le système CRE/LOX ?
CRE = derrière un promotteur exprimé dans le tissus que l'on veut
106
Qu'est-ce qu'un Knockin ?
Ajout d'un codon stop entre 2 loxP, qui sera enlevé dans l'organe où CRE est exprimé (donne accès au gène)
107
Pourquoi faire un knockin ?
Pour éviter la surexpression (ou ajout dans un seul organe en particulier)
108
Comment intègre-t-on le système CRE/LOX ?
Par recombinaison homologue
109
Quel est le problème pour corriger un gène défectueux dans l'embryon ?
Insertion aléatoire
110
Est-ce que la thérapie germinale est acceptée sur l'humain ?
NON
111
Est-ce que la thérapie somatique est acceptée sur l'humain ?
OUI
112
Qu'est-ce que la thérapie génique germinale ?
insertion de cellule transgénique dans le bouton embryonnaire du blastocyste
113
Qu'est-ce que la thérapie génique somatique ?
Correction d'un phénotype par traitement de quelques cellules somatiques
114
Est-ce que toutes les cellules deviennent transgéniques dans la thérapie génique somatique ?
NON (ex: chimère)
115
Quelle est la technique pour la thérapie génique somatique ?
Prélever des cell d'un malade + rendre ces cell transgénique (introduction de copies du gène cloné de type sauvage) + cell réintroduites dans le corps du malade
116
Quels sont les deux moyens utilisés pour introduire le transgène dans les cellules ? (virus)
- Rétrovirus inactivé (défectif) | - Adénovirus
117
Quelles sont les avantages des adénovirus ?
- Ne s'intègre pas dans le chromosome (bon pour traitement chez l'humain) - Attaque tous les types de cell (même celles qui ne prolifère pas - neurones)
118
Quelles sont les inconvénients des rétrovirus inactivé ?
- Insertion dans le génome des cell hôtes = effets mutagènes | - s'attaque seulement aux cellules en prolifération (pas neurones)
119
Qu'est-ce que Lentivirus ?
Mélange du rétro/adénovirus avec avantages des
120
Quels sont les avantages de Lentivirus ?
- S'insère dans le génome (pas de perte) | - peut attaqué les cellules qui ne prolifèrent pas
121
Nommez une autre méthode de thérapie génique - transporteur non-viral
Par les liposomes - autre méthode moins efficace avec ADN encapsidé à l'intérieur
122
Quel est la pathologie des enfants bulles ? Qu'est ce qu'elle fait ?
Syndrome de l'immunodéficience congénital (SCID) *réussite de la thérapie génique pour la 1ere fois > altération du gène responsable Fonctionnement anormal des lymphocytes B et T = infections répétés
123
Quelles cellules sont plus efficaces à traiter pour des maladies comme les enfants bulle ?
Utilisation de cellules de la moelle osseuse (cell souches)
124
Nommez un autre moyen d'introduire le transgène dans des cell
Chromosome artificiel humain (HAC) - transfecté à l'aide d'agents de transfection *Observation par sondes fluo
125
Qu'est-ce que la thérapie génique anti-sens ?
Empêche la protéine d'être produite *Nouvelle technologie | Cible : ARNm (qui va devenir double brin -siARN- et dégrader) > rend le gène silencieux
126
La thérapie génique anti-sens est-elle post-transcriptionelle ?
OUI
127
Qu'est-ce qu'un dsRNA ?
ARN double-brin (qui rend un gène spécifique silencieux)
128
D'où viennent les siRNA?
du clivage de long dsRNA par l'enzyme DICER en fragments | *sont recrutés à un complexe ribonucléase (RISC) qui induit le clivage de l'ARNm ciblé
129
De quel ARN le complexe RISC est-il composé ?
siRNA
130
Que font les siRNA ?
Permet d'inhiber la traduction | + pour contrôler les ARNm qu'on a introduit dans la cellule et lui permet de se diviser
131
Qu'Est-ce que les gRNA ?
Confère une résistance à la réinfection virale (effet mémoire)
132
Est-ce que l'édition du génome par Cas9 est précise ?6
OUI, enlève le gène de façon +++ précise
133
Qu'est-ce que la nucléase Cas9 clive ?
Les séquences homologue hybridé (double-brin) du gène > guide reconnu par Cas9
134
Que fait la thérapie génique anti-sens siRNA pour Fas ?
Fas = ligand de mort cellulaire | > Empêche de synthétiser la protéine FAS (Antisens sur l'ARNm qui produit FAS)
135
Est-ce qu'il est possible de détecter une mutation par analyse de type Southern en utilisant des sondes marquées ?
OUI (ex: modification des sites de restriction par mutations)

Biologie moléculaire (2 decks)

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