Examen théorique 2

Question 1

Nommer les 5 catégories de techniques de diagnostic de laboratoire

Answer 1

1. Méthodes microscopiques (clé d’identification: champignon, nématode, insectes)
2. Méthodes biologiques (Postulats de koch)
3. Méthodes biochimiques (Galerire API)
4. Méthodes immunologiques (Élisa)
5. Méthode moléculaires (PCR, qPCR)

Question 2

Décriver la structure d’un nucléotide.

Answer 2

1. Un sucre: désoxyribose (sucre à 5 carbones)
2. Un groupement phosphate (attachée au C5)
3. Une base azotée (attachée au C1)

Question 3

Décriver la structure de L’ADN.

Answer 3

Structure hélicoïdal à 2 brins placée de manières à ce que les bases soit positionné l’une vis-à vis l’autre. Ces bases azotés sont liée entres elles par des ponts hydrogènes

Question 4

Expliquer ce qu’on entend par fragment d’okazaki.

Answer 4

Les fragments d’Okazaki sont de courtes séquences de nucléotides d’ADN (environ 150 à 200 paires de bases de long chez les eucaryotes ) qui sont synthétisées de manière discontinue puis liées entre elles par l’ enzyme ADN ligase pour créer le brin en retard lors de la réplication de l’ADN

Question 5

Expliquer le rôle joué par les enzymes ADN polymérase, ADN ligase, et ADN hélicase dans la réplication de l’ADN.

Answer 5

ADN polymérase:
Synthétise un nouveau brin d’ADN complémentaire

ADN Ligase:
catalyse une liaison de phosphodiester entre deux nucléotides (attache les segments discontinu en un brin)

ADN hélicase:
Déroule et sépare les brin d’ADN parentaux

Question 6

Définir le terme gène.

Answer 6

Unité définie localisée sur un chromosome, grâce à laquelle se transmet un caractère héréditaire

Question 7

Expliquer la technique de la PCR et comparer avec la avec le processus de réplication d’ADN

Answer 7

PCR:
Cette technique permet de copier l’ADN des millions de fois sans passer par le clonage

comparaison de la méthodologie de la PCR avec chaque étape de la réplication d’ADN.

Réplication de l’ADN:
1. ADN
2. ADN hélicase
3. Protéines fixatrices d’ADN
4. Amorce d’ARN (ADN primase)
5. Nucléotide triphosphate
6. ADN ligase
7. ADN polymérase

PCR:
1. Extraction de L’ADN
2. Chauffer pour briser les liaisons hydrogène
3. Ajouter un surplus d’amorces spécialisées (plus de chance que l’ADN s’hybride à une amorce plutôt qu’à son brin complémentaire)
4. 2 amorces synthétiques
5. DNTP’s
6. Pas besoin de ligase puisqu’on n’a pas besoin de remplacer les nucléotides ( le brin n’est pas discontinu donc c’est automatiquement 5’ vers 3’)
7. Polymérase TAQ

Question 8

Expliquer les 3 étapes du cycle d’amplification.

Answer 8

Étape 1: la dénaturation
On va chauffer les brin d’ADN dans l’optique de briser les liaisons hydrogène entre les nucléotides

Étape 2: Hybridation des amorces
On insert des amorces qui vont encadrer la séquence d’ADN à amplifier pour permettre à la TAQ d’amplifier de 5’ vers 3’

Étape 3: Prolongation des amorces
La TAQ polymérase va crée les nouveaux brins

Question 9

Explique en quoi consistent une amorce, les dntp’s et la TAQ

Answer 9

Amorce: s’attache à une séquence d’un brin d’ADN simple pour éviter que son brin complémentaire se rattache à celui-ci (site de construction/ point de départ d’un mur de brique)

DNTP’: Nucléotide que l’on met dans notre master mix pour l’amplification (brique)

TAQ: Enzyme qui synthétise le brin complémentaire à partir de l’amorce ( celui qui assemble les briques)

Question 10

Expliquer le rôle et les caractéristiques de la polymérase TAQ

Answer 10

Rôle:
attacher les nucléotides à l’extr.mité du brin en formation 5’ vers 3’

Caractéristique:
-Provient d’une bactérie vivant dans les eaux thermales
- Température optimal : 72 celcius
- Demeure stable jusqu’à 94 celcius

Question 10

pourquoi devons nous colorer les échantillons avec du bleu avant la mise en gel ?

Answer 10

Afin de vérifier le bon déroulement d’une électrophorèse sur gel d’agarose. le bleu n’impactera pas l’ADN et va migrer plus rapidement que ce dernier pour agir sous forme de repère. (on veut éviter qu’il sorte du gel).

Il sert également à observer si notre adn est bien déposé dans les puits du gel

Question 11

Expliquer la technique d’électrophorèse sur gel

Answer 11

cette technique d’électrophorèse permet de séparer des molécules en fonction de leur charge, de leur taille (appelée poids moléculaire) ou les deux à la fois en les faisant migrer à travers un gel par application d’un champ électrique.

Question 12

définir anticorps monoclonaux

Answer 12

Anticorps spécifique à un antigène

Question 13

nommer différents type de marqueur fluorescents

Answer 13

-Agent intercalent Fluorescents (SYBR GREEN)

-Sonde fluorescente (TAQMAN)

Question 14

Nommer les phase de la réaction PCR

Answer 14

1. Phase d’amplification
2. Phase transitoire
3. Phase stationnaire

Question 15

Définir et expliquer le Cq

Answer 15

Cq est le nombre de cylce d’amplification nécessaire pour atteindre le signal seuil.

Cette varibale qui nous indique le seuil de détection (il correspond à 10% de la fluorescence émise pendant l’amplification) qui correspon au début de la phase exponentielle

Question 16

Quel est l’utilité du TM?

Answer 16

permet de connaitre la température de dénaturation et nous indique par le fait même la température à laquelle la moitié de l’ADN est double brin et l’autre est simples brin.

Question 17

Quel sont les deux méthode de quantification?

Answer 17

• Absoule
• Relative

Question 18

Quel sont les avantages de la qPCR?

Answer 18

• plus rapide que la PCR classique
• Absence de manipulation post PRC
• Plus sensible que la PCR classique
• Facilite l’analyse d’échantillon en grand nombre
• Résultat quantitatif

Question 19

Quel est le principe de la technique PCR en temps réel de la fluorescence avec le SYBR GREEN?

Answer 19

Durant l’étape de l’élongation, une augmentation de la fluorescence est associée à la quantité de SYBR GREEN se fixant à l’ADN double brin formé

Question 20

Quel est le principe de la technique PCR en temps réel de la fluorescence avec la sonde TAQMAN?

Answer 20

la sonde est une courte séquence spécifique marquée d’une molécule à une partie de la région à amplifier.
Elle possède un “reporter du côté 5’ et un “Quencher” du côté 3’. Le reporter émet de la lumière et le “quencher” absorbe l’énergie émise par le “reporter”.
Quand la polymérase arrive à la sonde lors de la synthétisation, elle dégrade la sonde et éloigne le “reporter” du “quencher”.
L’énergie lumineuse du “reporter” n’étant plus absorbé par le “quencher” est maintenant visible.

Question 21

Nommer les sources d’ADNe

Answer 21

• excrément
• poil
• mucus
• peaux
• salive
• urine

Question 22

Qu’est-ce qu’une séquence flaquante?

Answer 22

Une séquence flanquante est

Question 23

Qu’est-ce qu’un marqueur moléculaire? donnez des des exemples.

Answer 23

Séquence d’ADN qui est identique chez les individus de la même espèce, mais qui présente de la variabilité entre les espèces différentes
(ex: identique avec la même espèces d’abeille, mais variable avec d’autre espèces de la même famille)

Exemple de marqueur:
Gène COI (mammifère et poissons)
Gène 16S (bactéries)
Espaceur interne ITS (champignon)
Gène matK ou rbcL (plantes)

Question 24

Quel sont les caractéristiques d’un marqueur moléculaire?

Answer 24

• identique pour la même espèce, mais varie selon d’autre espèce
• gène

Question 25

Expliquer l’importance des témoins (test ÉLISA)

Answer 25

Témoin négatif: vérifier la spécificité et l’absence de couleur en absence de réaction.

Témoin positif: Couleur de référence de la réaction souhaité

Question 26

expliquer l’importance d’un blanc tampon

Answer 26

Permet de connaitre la couleur de fond lorsqu’il n’y a aucune réaction

Question 27

Expliquer l’importance d’un témoin négatif amplification

Answer 27

permet de mettre en évidence une contamination des réactif par de l’ADN recherché

Question 28

Expliquer l’importance d’un témoin positif d’extraction

Answer 28

échantillon connu qui subira toute les étapes pour valider l’extraction

Question 29

Expliquer un positif d’amplification et son importance

Answer 29

• C’est de l’ADN ayant été extrait lors de la PCR antérieur à la notre (elle est déja validé et sert aussi a valider notre master mixte)
• Cet adn va subir l’étape amplification

Question 30

Comment faire une coloration et une photographie

Answer 30

1. mettre notre gel dans un volume de bromure d’éthidium pendant 20 min une fois l’électrophorèse terminé
2. Décolorer à l’eau distillé et déposer le gel sur une plaque de verre propre
3. prendre une photo avec une caméra numérique

Question 31

En quoi consiste l’ADNe?

Answer 31

vise à détecter une espèce cible dans l’environnement