Extraction de l'ARN à l'aide du réactif Trizol

Question 1

Quel est le type de clonage effectué au projet 1?

Answer 1

Clonage de type U/A avec vecteur spécialisé pour insertion de produits de PCR

Question 2

Quelle propriété a l’ADN polymérase Taq utilisée dans le PCR?

Answer 2

Ajouter un nucléotide A à l’extrémité 3’ de ses produits de PCR

Question 3

Quelle molécule est compatible aux produits de PCR produits par l’ADN polymérase Taq?

Answer 3

Vecteur muni d’un U ou d’un T à ses extrémités

Question 4

Quel vecteur a été utilisé pour le clonage du projet 1 et quelle est sa particularité?

Answer 4

Vecteur pDrive linéarisé et possède un nucléotide U à ses extrémités 3’

Question 5

Quel ADN a été cloné dans le projet 1?

Answer 5

Fragment d’ADNc de la b-actine (ACTB)

Question 6

Quelles son les particularités de l’actine?

Answer 6

Protéine exprimée dans toutes les cellules et fortement conservée chez les eucaryotes

Question 7

Décrire la b-actine.

Answer 7

Protéine structurale, non musculaire, qui intervient dans la mobilité cellulaire

Question 8

Comment a-t-on créé notre ADNc?

Answer 8

ARN de cellules qui expriment le gène de la b-actine a été extrait et purifié afin de produire l’ADNc (par RT-PCR avec amorces spécifiques à séquence de b-actine)

Question 9

Quelles sont les 3 catégories d’ARN chez les eucaryotes?

Answer 9

ARN ribosomiques
ARN de transfert
ARN messagers

Question 10

Quel sont les poids (sédimentation) des ARN ribosomiques?

Answer 10

28S
18S
5,8S
5S

Question 11

Quel est le poids (sédimentation) des ARN de transfert?

Answer 11

5S

Question 12

Quels sont les poids (sédimentation) des ARN messagers?

Answer 12

poids moléculaire et formes hétérogènes

Question 13

Quel pourcentage de l’ARN cellulaire total constitue les ARN ribosomiques?

Answer 13

80%

Question 14

Que signifie le fait que la valeur S est plus élevée?

Answer 14

Déplacement de la molécule plus rapide lorsque soumise à une force centrifuge
Taille de la molécule plus grande

Question 15

Quel pourcentage de l’ARN cellulaire total constitue les ARN de transfert?

Answer 15

Environ 18%

Question 16

Selon quelles propriétés peut-on purifier des ARN de transfert et pourquoi?

Answer 16

Selon leur poids ou leur densité car ils sont homogènes dans leur composition

Question 17

Quel pourcentage de l’ARN cellulaire total constitue les ARN messagers?

Answer 17

Environ 2%

Question 18

Les ARN messagers ont-ils les mêmes poids moléculaires et formes?

Answer 18

Non, poids et formes hétérogènes

Question 19

Comment peut-on purifier des ARN messagers?

Answer 19

Par affinité sur colonne de cellulose oligo-(DT) (grâce à leur chaîne terminale polyadénylée)

Question 20

Quels ARN sont impliqués dans les mécanismes de synthèse protéique de façon non-spécifique?

Answer 20

ARN de transfert

ARN ribosomique

Question 21

Quels ARN déterminent le niveau d’expression des protéines de la cellule?

Answer 21

ARN messagers

Question 22

Pourquoi s’intéresse-t-on aux ARN messagers dans la majorité des études cellulaires?

Answer 22

Puisqu’ils déterminent le niveau d’expression des protéines de la cellule

Question 23

Qu’est-ce qui détermine la quantité d’ARN messagers à l’instant donné dans la cellule?

Answer 23

L’équilibre entre la vitesse de dégradation et la vitesse de synthèse

Question 24

Où peut-on retrouver les ribonucléases?

Answer 24

Partout : cellules-mêmes des organes. réactif, sur les mains et sur la verrerie

Question 25

Comment vérifie-t-on l'état de l'ARN après une extraction?

Answer 25

Sur gel d'agarose non dénaturant

Question 26

Quelles bandes sont prédominantes sur gel d'agarose de l'ARN s'il est intact?

Answer 26

Bandes des ARNr 28S et 18S sont prédominantes en proportion environ 2:1 Autres bandes de poids moléculaires et intensités variables dont 5S

Question 27

Quelles sont les 3 sources de contamination par les ribonucléases?

Answer 27

Matériel et solutions Manipulateur RNases de sources internes

Question 28

Comment évite-t-on la contamination par le matériel?

Answer 28

Utiliser matériel stérile et à usage unique (idéalement en plastique) Faire subir verrerie traitement : soit 180 degrés pendant 8 heures ou tremper pendant 10 min dans NaOH 0,5M et rincer avec eau

Question 29

Comment évite-t-on la contamination par les solutions?

Answer 29

Préparer solutions avec eau exempte de nucléases et produits réservés juste pour manip avec ARN

Question 30

Comment évite-t-on la contamination par le manipulateur?

Answer 30

Porter des gants jetables et les changer chq fois que contact avec vaisselle ou surfaces souillées

Question 31

Comment évite-t-on la contamination par les sources externes?

Answer 31

Utiliser inhibiteurs de RNase : - Détergents forts (SDS) - Complexes Vanadyl-ribonucléoside - Guanidine isothiocyanate 4M

Question 32

Décrire les détergents forts (SDS).

Answer 32

Agents dénaturants très puissants, mais pas efficace à 100%

Question 33

Décrire les complexes Vanadyl-ribonucléoside.

Answer 33

Inhibiteurs de RNase très efficaces Doivent être séparés de l'ARN par extraction au phénol-chloroforme (phénol = aussi agent dénaturant)

Question 34

Décrire la guanidine isothiocyanate 4M.

Answer 34

Agent dénaturant très puissant qui, combiné à agent réducteur (b-mercaptoéthanol) détruit activité RNasique presque instantannément

Question 35

Quel réactif dans le lab a servi à la lyse des cellules?

Answer 35

TRIzol

Question 36

De quelles cellules a été extrait l'ARN dans le lab?

Answer 36

Fibroblastes de souris NIH 3T3

Question 37

De quoi est composé le réactif TRIzol?

Answer 37

Solution monophasique de phénol et guanidine isothiocyanate

Question 38

Que fait le réactif TRIzol?

Answer 38

Maintient l'intégrité de l'ARN pendant l'homogénéisation ou la lyse de l'échantillon Fait éclater les cellules en dissolvant leur composantes cellulaires et en inactivant les RNases libérées

Question 39

Quel réactif sert à la séparation de l'ARN?

Answer 39

Chloroforme

Question 40

Quel réactif sert à la précipitation de l'ARN?

Answer 40

Isopropanol

Question 41

Quelle solution sert au lavage de l'ARN?

Answer 41

Éthanol 75%

Question 42

Quelle solution sert à la solubilisation de l'ARN?

Answer 42

Eau ultra pure

Question 43

Quelles sont les étapes d'extraction de l'ARN (brièvement)?

Answer 43

``` Lyse des cellules Séparation de l'ARN Précipitation de l'ARN Lavage de l'ARN Solubilisation de l'ARN ```

Question 44

Comment peut-on évaluer la concentration en ARN d'une solution?

Answer 44

Lecture de l'absorbance à 260 nm avec un spectrophotomètre

Question 45

Sur quelle observation est basé le dosage de la concentration en ARN d'une solution au spectrophotomètre?

Answer 45

Bases puriques et pyrimidiques absorbent fortement à cette l.o. Spectre d'absorption ADN et ARN max à 260 nm

Question 46

À quelle concentration d'ARN correspond une unité à 260 nm?

Answer 46

40 ug ARN/ml

Question 47

À quelle concentration d'ADN double brin correspond une unité à 260 nm?

Answer 47

50 ug ADN db/ ml

Question 48

À quelle concentration d'ADN simple brin correspond une unité à 260 nm?

Answer 48

33 ug ADN sb / ml

Question 49

Est-ce que toutes les bases azotées absorbent à 260 nm au même niveau?

Answer 49

Non

Question 50

Que permet le dosage au spectrophotomètre?

Answer 50

Connaître qté ADN et ARN | permet d'avoir un indice de pureté de l'échantillon

Question 51

Quels ratio informent de la présence d'autres molécules contaminantes dans l'échantillon?

Answer 51

260/280 | 260/230

Question 52

Quelle composante contaminante baisse le ration 260/280?

Answer 52

Protéines

Question 53

Quel appareil permet de faire le dosage d'ARN au lab?

Answer 53

NanoDrop

Question 54

Quelle est la particularité du NanoDrop?

Answer 54

Conçu pour doser de très faibles volumes

Question 55

Que permet de visualiser l'électrophorèse en gel d'agarose des extraits d'ARN?

Answer 55

Qualité de la préparation | Corroborer l'évaluation de la concentration établie au NanoDrop