FERM -- Chapter 2: Microbiële Groei

Question 1

Wat zijn directe methodes voor schatten van biomassa?

Answer 1

Methoden die direct de hoeveelheid cellen of biomassa bepalen.

Question 2

Wat zijn de indirecte methodes voor schatten van biomassa en waarom?

Answer 2

bepaalde aspecten linken aan het aantal cellen of celmassa

Omdat directe methode niet altijd mogelijk is

Question 3

Welke methoden kan men gebruiken voor meten van het aantal cellen?

Answer 3

• directe telmethoden (microscopisch tellen of elektronische telapparaten)
• uitplaten (spreidplaat- en gietplaatmethode)

Question 4

Hoe werkt de directe telmethode?

Answer 4

Men telt het aantal cellen in een gekend volume en bepaald dan het aantal cellen in het groter geheel door extrapolatie.
Hiervoor moet de concentratie aan cellen hoog genoeg zijn. En men heeft een telkamer en microscoop nodig

Specifiek: verdunnen indien nodig
vullen van de kamer met micropipet
plaats dit op het platform van de microscoop
tel het aantal cellen
bereken de concentratie aan cellen per ml oplossing

Note: tel altijd meer dan 1 vierkant (bv. 5 – 1 in het midden en 4 op elke hoek) voor cellen op de rand die deels in een ander vakje liggen telt men bij 2 van de 4 kanten mee, en bij de 2 andere niet.

Question 5

Wat is een telkamer?

Answer 5

Glaasje waarop lijnen gegraveerd zijn die het in kleine vierkantjes verdeeld. Variërend van hele kleine vierkantjes naar relatief grote vierkantjes. hierop leg je dan een dekglaasje. Men kent het de oppervlakte van zo’n vierkantje alsook de diepte van het het glaasje t.o.v. het dekglaasje. dus het volume in een vakje ook.

Question 6

Wat is cytometrie?

Answer 6

meten van fysische of chemische (bv. grootte van een cel, pH van een cel, …) eigenschappen van cellen of andere biologische deeltjes.

Question 7

Hoe werkt flow cytometrie? (teken ook)

Answer 7

We duwen het sample door een soort trechter in een vloeistofstroom waardoor cellen cel per cel zullen doorgaan. Dit kan men elektronisch detecteren en tellen.

Question 8

Wat is flow cytometric cell sorting?

Answer 8

Uitbreiding op flow cytometrie die cellen kan sorteren op basis van grootte/vorm (dus telt eerst en sorteert ze dan nog is voor eventuele verdere analyse)

Question 9

Wat is FACS?

Answer 9

fluorescence activated cell sorting
Om levende en dode cellen te onderscheiden. Bepaalde producten op de markt die levende cellen of dode cellen kunnen markeren omwille van bepaalde stoffen die wel/niet aanwezig zijn en zo kan men ze onderscheiden.

Question 10

Wat zijn de uitplaatmethoden?

Answer 10

Men telt enkel de levende cellen.

Wanneer we aannemen dat een kolonie ontstaat uit 1 enkel micro-organisme (CFU – colony forming unit). in geschikt agar medium en onder geschikte omstandigheden. Dan kunnen we o.b.v. het aantal CFU’s een schatting maken van het aantal levende cellen in de originele suspensie.

Question 11

Waarom ziet men uitplaatmethoden als een minimum telling?

Answer 11

dit is een minimum telling, want niet alle micro-organismen zijn in staat te groeien op een plaat, en niet alle micro-organismen groeien even goed op een plaat.
Maar ongeveer 1% van alle soorten micro-organismen zijn kweekbaar in het labo
Verder kunnen cellen samenklitten waardoor inaccurate metingen kunnen ontstaan. Dit kan verholpen worden door bepaalde detergenten toe te voegen om ze uit elkaar te halen

Question 12

Hoe gaat de uitplaatmethode tewerk?

Answer 12

Indien nodig verdunnen (vb. verdunningsreeks)
Uitplaten (spreidplaat of gietplaat)
–> vaak 0.1 ml staal op/in medium voor spreidplaat
–> 1 ml voor gietplaat
incuberen (naargelang de condities)
Tellen (platen met 30-300 CFU’s)
-> minder kolonies = onbetrouwbaar
-> teveel kolonies = teveel/moeilijk om te tellen
Berekenen (aantal kolonies * verdunningsfactor) [cellen/ml] — let altijd op de eenheden!

Belangrijk is om per verdunning 2 replicaten te maken

Moet ook altijd nabij de bunzenbrander gebeuren omdat het steriel moet gebeuren.

Question 13

Verschil gietplaat en spreidplaatmethode

Answer 13

Spreidplaatmethode: sample OP medium, wordt dan verspreid, geincubeerd en dan zullen kolonies zich OP het oppervlak vormen

gietplaatmethode: sample wordt in steriel schaaltje gebracht, het medium wordt dan toegevoegd en gemengd, geincubeerd en dan zullen kolonies zich IN het medium en OP het oppervlak vormen.
Het nadeel van deze methode is dat het moeilijker is om te tellen

Question 14

Wanneer wordt de spreidplaatmethode gebruikt en wanneer de gietplaatmethode?

Answer 14

spreid: groei van aerobe micro-organismen, anaeroob kan maar dan moet het anaeroob geincubeerd worden
giet: groei van aerobe, anaerobe en micro-aerofiele (kleine hoeveelheid zuurstof nodig) micro-organismen

Question 15

wat zijn rijke en arme media?

Answer 15

arme media bevatten weinig nutrienten (als we water samples willen nabootsen)
rijke media bevatten wel veel nutrienten (als we bodemstalen willen gebruiken)

Question 16

wat zijn algemene media en selectieve media?

Answer 16

Algemene media zijn ontworpen voor zoveel mogelijk verschillende micro-organismen

selectieve media worden gebruikt om 1 bepaald micro-organisme te laten groeien. Hier kan men bepaalde stoffen aan toevoegen om het nog gunstiger te maken voor het specifieke organisme. Een voorbeeld hiervan is een antifungaal middel (cycloheximide).

Question 17

Wat zijn de oorzaken van fouten?

Answer 17

• fout bij pipeteren of niet goed mengen
• samenklitten van cellen
• sterven van cellen in verdunningsvloeistof
• niet van hoog naar laag werken bij verdunnen (of niet veranderen van pipetpunt indien van laag naar hoog)
• temperatuur van gesmolten medium te hoog voor de cellen
• foute keuze van medium
• contaminaties (niet steriel werken)
• rivaliteit tussen 2 verschillende soorten micro-organismen

BELANGRIJK:
werk dus altijd van hoge verdunning naar lage verdunning en werk steriel, met de juiste producten

Question 18

Hoe kunnen we de celmassa gaan meten?

Answer 18

direct: droog/nat gewicht
indirect: spectrofotometer
andere: volumemetingen

Question 19

Leg het principe van directe meting van celmassa.

Answer 19

celmassa is evenredig met het gewicht van het celmateriaal (droog gewicht of nat gewicht)

Question 20

Hoe gaan we tewerk voor het droog gewicht?

Answer 20

we scheiden de cellen van het medium door centrifugatie of filtratie. We wassen de cellen om eventuele onzuiverheden weg te krijgen.
Dan drogen we de cellen in een oven (rond 105 graden)
En dan wegen we dit.

Question 21

Hoe gaan we tewerk voor het nat/vers gewicht?

Answer 21

we scheiden de cellen van het medium door centrifugatie of filtratie. We wassen de cellen om eventuele onzuiverheden weg te krijgen. Dit kunnen we dan wegen. Het totale gewicht is hier het drooggewicht + intracellulair water + extracellulair water.
Nadeel: minder accuraat want er zal een deel al kunnen verdampen, wat leidt tot variaties.
Maar goeie methode als er geen oven beschikbaar is.

Question 22

Hoe werken de indirecte methoden voor celmassa bepaling

Answer 22

licht met bepaalde intensiteit gaat door een sample en wordt verstrooid door de micro-organismen. Het niet verstrooide licht wordt gedetecteerd.
Voor de spectrofotometer:
Absorbance = log (I_in / I_detected), dit kan men linken aan concentratie, wat men kan linken aan massa
Voor een nephelometer:
Hier meet men net het licht dat verstrooid wordt en linkt men dit aan de concentratie, wat dan aan de massa gelinkt kan worden.

Dit komt omdat we hebben een lineair verband voor kleine concentraties

Question 23

Hoe kan men aan de hand van het volume de massa schatten? Wat is PCV en waar hangt het vanaf?

Answer 23

in een gegradueerd centrifugebuisje kan men centrifugeren en het volume aan cellen op de bodem bekijken. Een goede schatting voor het droog volume is meestal volume/5
Dit volume noemt men Packed Cell Volume (PCV)
hangt af van duur en snelheid centrifugatie.

Nadeel: moet dus zeer gestandardiseerd gebeuren.

Question 24

Wat zijn de belangrijke componenten van cellen (algemeen) en welke gebruiken we niet voor metingen en waarom?

Answer 24

Proteinen (ong. 60%)
RNA (minder gebruikt)
DNA
Lipiden (minder gebruikt)
Carbs (minder gebruikt)
(ATP=energie)

Minder gebruikt: men gebruikt deze zelden omdat ze sterk afhangen van de situatie/omgeving.

Question 25

Hoe kunnen we proteinen meten en hoe kunnen we dit gebruiken voor meting van cellen?

Answer 25

60-65% van het celgewicht (droog) is de proteinen. Als we proteinen kunnen scheiden en wegen, kan dit gebruikt worden om het celgewicht te schatten. Verschillende methoden: - kleurreactiemethoden - chemische methoden

Question 26

Hoe kunnen we DNA gebruiken voor meting van cellen?

Answer 26

DNA in biomassa is ongeveer constant (relatief) | Men kan kleurreactie gebruiken om het op te meten.

Question 27

Welke methoden zijn er voor DNA analyse?

Answer 27

- UV absorbance meten - fluorescence meten - diphenylamine methode

Question 28

Hoe kunnen we ATP gebruiken voor meting van cellen?

Answer 28

ATP gehalte is ook relatief constant net als DNA. Wel enkel in levende cellen.

Question 29

Wat is de methode voor ATP analyse

Answer 29

Men voegt een bepaalde substraat en een bepaald enzym toe aan het staal (luciferine en luciferase resp.) Luciferase zet met behulp van zuurstof met ATP op tot licht. Men noemt dit een bioluminescente reactie. Men kan dit licht dan meten met een luminometer en correleren aan de hoeveelheid

Question 30

Wat is een bioluminescente reactie en geef een voorbeeld?

Answer 30

biologische reactie waar energie vrijkomt in de vorm van licht. Dit gebeurt in het achterwerk van een vuurvlieg

Question 31

Hoe kunnen we biomassa meten op basis van nutrientconsumptie en/of productvorming?

Answer 31

``` consumptie • Carbon source consumptie • Nitrogen source consumptie • O2 consumptie vorming • CO2 vorming • warmteproductie ```

Question 32

Hoe kunnen we biomassa meten op basis van nutrientconsumptie specifiek?

Answer 32

De belangrijkste elementen voor de celgroei zijn de koolstofbronnen en de stikstofbronnen (en O2 voor aerobe micro-organismen). [We kunnen dit wiskundig weergeven (zie volgende lessen)] Analoog voor de productvorming: warmte en CO2 zijn het belangrijkste

Question 33

Hoe werkt die koolstofbron consumptie methode?

Answer 33

Koolstof neemt ongeveer 47-53% van het droge gewicht in. C_biomassa = C_consumed - C_co2 - C_fermentatieproducten Let hier op dat we niet zomaar het geconsumeerde C kunnen wegen en stellen dat dit de hoeveelheid C is. En dat we dus 3 metingen moeten doen (cons, co2, fermentatieprod) Aangezien een deel van de aanwezige C gebruikt wordt in de fermentatieproducten en in CO2

Question 34

Wat is de meest gebruikte meting o.b.v. consumptie of vorming?

Answer 34

Gevormde CO2 meten

Question 35

In welke soort culturen kunnen fermentatieprocessen plaatsvinden?

Answer 35

- batch culture - fed batch culture - continuous culture

Question 36

Welke soort cultuur gebruikt men meestal als men geïnteresseerd is in secundaire metabolieten?

Answer 36

Batch of fed-batch culture

Question 37

Welke soort cultuur gebruikt men meestal als men geïnteresseerd is in primaire metabolieten en/of biomassa?

Answer 37

Continuous batch culture

Question 38

Wat is batch culture?

Answer 38

Een gesloten systeem waar men alles indoet, en dan laat men dit gewoon doen. Er is geen verdere toevoeging van nutriënten. Het enige waar men nog controle over heeft is de zuurstoftoevoer indien nodig en de pH door toevoeging zuur/base

Question 39

Wat is de werkwijze bij een Batch culture?

Answer 39

- fermentor wordt gevuld, gesteriliseerd, innoculatie - microbiele groei vind plaats volgens het typische profiel (lag, log, stat, die) - gewenste product wordt gewonnen (door bv filtratie) - schoonmaken fermentor, en terug naar stap 1 voor de volgende batch

Question 40

Wat is fed-batch culture?

Answer 40

Hier wordt er tijdens het fermentatieproces nutrienten toegevoegd. Dit blijft doorgaan tot de fermentor vol is. (dit toevoegen kan continue of in delen gebeuren, of gewoon eenmaal)

Question 41

Wat zijn de voor- en nadelen van (fed-)batch culture?

Answer 41

+ Geen hoge investering nodig + Bij contaminatie, makkelijk opnieuw te starten + Efficient voor productie van secundaire metabolieten - Maar een klein deel is productief - Niet elke batch zal gelijk zijn - Kosten voor voorbereiden, onderhouden stock culturen.

Question 42

Wat is continuous culture?

Answer 42

Een open systeem waar men constant toevoer van medium heeft, en tegelijk evenveel cultuur die eruit wordt gehaald.

Question 43

Wat zijn de voor- en nadelen van continuous culture?

Answer 43

+ Productiever + Log (exp-) fase voor lange periode + productiever dan fed-batch/batch + geschikter voor productie biomassa of primaire metabolieten - Hogere investering - Steriel kunnen houden, contaminatie moet op tijd worden gedetecteerd

Question 44

Welke 2 beperkingen zorgen ervoor dat de groei niet oneindig kan doorgaan?

Answer 44

substraatlimitatie = opraken van essentiele nutrienten en/of toxine-limitatie = accumulatie van toxische stoffen

Question 45

Hoe kan men de aard van de groeibeperking achterhalen?

Answer 45

Het organisme laten opgroeien in een reeks substraten en op een grafiek uitzetten: x-as = initiele substraatconcentratie y-as = concentratie biomassa in stationaire fase [Teken zo'n grafiek]

Question 46

Wat beschrijft de MONOD-vergelijking?

Answer 46

afname van de groeisnelheid en het stoppen van de groei te wijten aan substraatuitputting

Question 47

Hoe gebruiken we de MONOD-vergelijking?

Answer 47

- Start batch fermentatie met S_R - meet s en mhu ifv tijd - plot mhu ifv s

Question 48

Wat gebeurt er met K_s bij hoge affiniteit tussen organisme en substraat en wat bij lage?

Answer 48

Hoge affiniteit = lage K_s (Log fase wordt langer -- zone AB op grafiek -- deceleration fase wordt korter -- zone AC) Lage affiniteit = K_s wordt hoger ((Log fase wordt korter -- zone AB op grafiek -- deceleration fase wordt langer -- zone AC))

Question 49

Wat zijn primaire metabolieten

Answer 49

Producten die vrijkomen die (rechtstreeks) gerelateerd kunnen worden een groei indien de specifieke productvormings rate omhoog gaat, zal de groeisnelheid ook omhoog gaan

Question 50

Wat zijn secundaire metabolieten

Answer 50

Producten die vrijkomen die NIET (rechtstreeks) gerelateerd kunnen worden een groei specifieke productvormings rate kan constant blijven of complex varieren, maar er is geen relatie met de groei.

Question 51

Waar moeten we naar streven bij batch cultuur in de volgende gevallen? interesseproduct = biomassa interesseproduct = primaire metabolieten interesseproduct = secundaire metabolieten

Answer 51

- biomassa: maximale celpopulatie door optimale culturele condities te voorzien - primair: exponentiele fase zo lang mogelijk maken - secundair: stationaire fase zo lang mogelijk maken

Question 52

Wat zijn de voor- en nadelen van continuous culture?

Answer 52

``` + Hogere productiviteit + Makkelijk automatiseerbaar -> feedback systeem -- zelfbesturend -> steady state -- parameters constant + Uniformiteit ``` - vatbaarheid voor contaminatie - > binnenaf -- grotere kans hoe langer het proces bezig is - > buitenaf -- fermentor design aanpassen