Fermentation Flashcards
Qu’est-ce que l’étude d’enzymes avec essai couplé?
◼ Exemple: Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase GAPDH
◼ Mesurer la production de NADH avec spectrophotométrie à 340 nm
◼ Calcul des concentrations
Qu’est-ce que l’étude du mécanisme enzymatique de la GAPDH?
Études avec inhibiteurs et avec isotopes
- transfert d’un groupement phosphate pour un H + H+
Qu’est-ce que l’étude du mécanisme enzymatique de la GAPDH par l’utilisation d’inhibiteurs?
Utilisation d’inhibiteurs de fonction connue
* Formation d’une liaison covalente avec l’inhibiteur
* Détection de la molécule résultante possible
Quel est l’exemple de l’emploi de l’iodoacétate?
o L’exemple utilisé emploie l’iodoacétate, un agent alkylant
o Si l’enzyme est inhibée, cela indique que son mécanisme implique une
cystéine
Avec quelle méthode peut-on détecter la molécule résultante?
Spectrométrie de masse
Pourquoi l’iodoacétate inhibera seulement les cystéines du site actif et pas les autres cystéines?
+ accessibles que les autres
Qu’est-ce que l’étude du mécanisme enzymatique de la GAPDH par l’utilisation de substrats marqués?
En marquant différents résidus du substrat, il est possible de valider
lesquels sont impliqués dans la réaction
Que permet de suivre l’utilisation de tritium?
l’utilisation de tritium (3H) permet de suivre l’apparition de NADH marqué et de déterminer quel hydrogène est impliqué dans la réaction.
* Permet de voir que le mécanisme est un transfert direct d’ion
hydrure
Est-ce qu’il y a des conditions partculières qui peuvent limiter
l’utilisation des résultats de cette expérience? Pourquoi?
- Fonctionne seulement in vitro avec des enzymes purifiées car plusieurs réactions enzymatiques produisent du NADH.
- Si on prenait un extrait cellulaire par exemple, on ne connaitrait pas
la provenance du NADH marqué (pourrait venir d’une autre réaction enzymatique)
Qu’est-ce que l’étude du mécanisme enzymatique de la GAPDH par l’utilisation d’intermédiaires acyl-enzyme?
*L’intermédiaire acyl-enzyme est un intermédiaire transitoire et difficile à étudier : c’est un complexe qui se forme entre le substrat et l’enzyme dans plusieurs enzymes importantes et qui est essentiel à la catalyse
*L’échange isotopique permet de faire la distinction entre réaction ping-pong et séquentielle
Signification échange isotopique
Mécanisme ping-pong : s’il n’y a pas de second substrat, échange isotopique possible
Mécanisme séquentiel : pas d’échange isotopique possible à cause du complexe enzyme-substrat
Exemple acétyl phosphate
- En utilisant du phosphate inorganique marqué avec un isotope on observe que :
- GAPDH échange le phosphore de l’acétyl phosphate avec le phosphore du phosphate inorganique
- C’est la réaction inverse qui est utilisée (1,3- BPG (ici acétyl phosphate) + H+ → GAP + Pi)
Fermentation homolactique
- Le NAD+ est renouvelé grâce à la réduction de pyruvate
- Dans le muscle et les bactéries lactiques
- Enzyme : lactate déshydrogénase (LDH)
- La LDH est stéréospécifique-transfert de l’ion hydrure
Cofacteur NAD
- NAD = Nicotinamide adénine dinucléotide
- Cofacteur pour les oxydoréductases * Porteur des équivalents réducteurs
Isoformes LDH
- Enzymes LDH sont tétramères dans les mammifères
- Deux types de sous-unités dans les mammifères: M et H
- Donne 5 isoenzymes : M4, M3H, M2H2, MH3, H4
- H domine dans tissus aérobies (muscle cardiaque)
- M domine dans les tissus qui peuvent être en anaérobie (muscles squelettiques et foie)
Régulation des isoformes de LDH
- La régulation allostérique de la LDH par le pyruvate diffère selon les isoformes
- H4 est inhibée par le pyruvate (tissus aérobie)
- M4 n’est pas inhibée par le pyruvate (tissus anaérobie)
Les isoenzymes sont?
Des enzymes codées par des gènes similaires, mais pas identiques
Isoenzymes
Enzymes qui sont issues de différences dans la structure primaire
(chaîne peptidique). Cause = génétique
* Pas approprié de nommer isoenzymes des différences causées par des modifications post-traductionnelles
* Ont généralement des propriétés physicochimiques différentes (ex: mobilité électrophorétique, résistance à l’inactivation thermique
ou chimique)
* Ont généralement des différences dans leurs propriétés catalytiques
* Peuvent toutes catalyser la même réaction
Pourquoi produire du lactate?
Permet de regénérer le NAD+ qui est nécessaire à maintenir la glycolyse
Effet de Warburg
- L’effet Warburg - usage d’une voie métabolique «défavorable» ( prod. ATP)
- Conversion de glucose en lactate malgré la présence d’oxygène
Avantages glycolyse vs phosphorylation oxydative
Voies de biosynthèses alternatives sont favorisées : Constituants nécessaires à la prolifération cellulaire
Avantage pour cellules qui se divisent rapidement
Test colorimétrique de la lyse des cellules
- La LDH est présente dans toutes les cellules
- La LDH se retrouve dans le surnageant des cultures si les cellules
lysent, p.ex. en présence d’un composé toxique - En mettant les cellules en culture en plaques multi-puits, il est possible de tester de multiples conditions de toxicité (composés et doses) grâce à un test enzymatique simple
Application de la LDH pour tests de toxicité
La détection de la LDH (indicateur de lyse cellulaire) est possible avec un essai couplé de deux réactions enzymatiques :
La réduction du formazan peut être mesurée par spectrophotométrie
LDH biomarqueur en clinique
L-Lactate + NAD+ + H+ → Pyruvate + NADH+
Dosé en contexte clinique pour voir la lyse tumorale (leucémies, autres cancers) ou la lyse cellulaire générale (choc, trauma)
