GE: section 6

Question 1

Lorsque l’on procède à la production d’un extrait de protéine totale, dans certains cas on doit ajouter dans le tampon d’extraction des inhibiteurs de phosphatases, pourquoi ?

Answer 1

Pour inhiber la perte des groupements phosphates des protéines (maintenir la phosphorylation post-traductionnelle)

Question 2

Lorsque l’on souhaite évaluer la concentration protéique d’un échantillon, quel appareil de base est requis pour effectuer les lectures ? (autre qu’un réfractomètre utilisé lors de l’estimation des protéines totales dans le plasma ou le sérum)

Answer 2

Spectrophotomètre

Question 3

Nommez 1 protéine qui est utilisée comme référence pour générer une courbe standard (étalon).

Answer 3

Albumine

immunoglobine

Question 4

Pourquoi dois-je produire 2 à 3 dilutions de mon échantillon protéique inconnu dont je souhaite déterminer la concentration protéique afin d’obtenir une quantification plus précise ?

Answer 4

Pour s’assurer que l’une des dilutions entre dans l’intervalle défini par ma courbe standard. Si l’échantillon n’est pas assez dilué et qu’il n’entre pas dans la courbe, on ne pourra pas déterminer sa concentration.

Question 5

Quel type de gel est principalement utilisé lors de la séparation par électrophorèse des protéines ?

Answer 5

Le gel PAGE-SDS

PolyAcrylamide Gel Electrophoresis-SDS

Question 6

Lors d’une analyse par électrophorèse, on ajoute un détergent nommé SDS (sodium docécyl sulfate), quel est le rôle de ce détergent dans la migration des protéines ?

Answer 6

Conférer une charge négative aux protéines pour qu’elles migrent vers l’anode (+)

Question 7

La séparation des protéines selon leur masse (poids moléculaire) nécessite une migration sur gel de type vertical discontinu où l’on retrouve 2 gels superposés. Quel est le rôle de chacun de ces gels ?

Answer 7

1er gel permet de concentrer les protéines,

2e gel permet de séparer les protéines.

Question 8

Lors de certaines analyses d’extraits protéiques, pourquoi réalise-t-on une analyse de type bi-dimensionnelle ?

Answer 8

Pour prendre en compte le fait que la charge totale des protéines varie selon le pH du milieu et arriver à une identification plus précise des protéines.

Question 9

L’analyse des protéines par électrophorèse bi-dimensionnelle se base sur quels paramètres pour séparer les protéines et dans quel ordre la séparation des protéines est-elle effectuée ?

Answer 9

1. Par charge électrique (électrofocalisation)

2. Par poids moléculaire

Question 10

Suite à la séparation des protéines par électrophorèse (1D ou 2D), vous souhaitez réaliser l’analyse d’une protéine spécifique. Quel est l’un des noms donnés à ce type d’analyse ?

Answer 10

Immunoblot (analyse Western)

Question 11

Dans cette approche analytique, quel est “l’outil” de base qui me permet de reconnaître la protéine que je souhaite analyser ?

Answer 11

Un anticorps primaire et un anticorps secondaire couplé à une enzyme.

Question 12

Quel est le rôle du « blocking agent » (lait ou BSA)

Answer 12

Empêcher que les anticorps/enzymes se fixent directement à la membrane où il n’y a pas de protéine.

Question 13

Quel est le nom donné à la technique d’analyse, lorsque je souhaite identifier une protéine exprimée (ou contenue) sur une coupe histologique ?

Answer 13

Immunohistochimie

Question 14

Quel est le rôle du 2ième anticorps utilisé lors de cette technique ?

Answer 14

Le 2e anticorps reconnaît le 1er anticorps et augmente la sensibilité à reconnaître le complexe protéine/premier anticorps.

Question 15

Nommez les différentes méthodes pouvant permettre la détection du complexe «protéine/1er anticorps/2e anticorps».

Answer 15

1. Colorimétrie enzymatique
2. Excitation par une longueur d’onde (fluorescence)
3. par autoradiographie (radioactivité)
4. microscopie électronique (particule d’or)

Question 16

Dans les techniques d’ELISA, neutralisation sérique, agglutination, pourquoi est-il nécessaire d’incorporer une courbe standard (étalon) ?

Answer 16

Comme on veut déterminer une concentration d’un échantillon inconnu, il est nécessaire de pouvoir comparer avec une concentration connue.

Question 17

Dans la technique d’ELISA, quel est “l’outil” de base qui me permet de déterminer la concentration de ma protéine d’intérêt

Answer 17

2 anticorps, dont une est couplé à une enzyme.

Question 18

En quoi le test de neutralisation sérique est-il plus complexe à réaliser que le test ELISA

Answer 18

Le test de neutralisation sérique implique des cellules vivantes, tandis que l’ELISA ne demande que le sérum de l’animal.

Question 19

Expliquer le concept du test d’inhibition de l’hémagglutination (IHA)

Answer 19

Les virus se lient aux globules rouges pour faire de l’hémagglutination. En présence d’anticorps, ceux-ci se lient aux virus et empêchent l’hémagglutination.

Question 20

Qu’est-ce qu’un sérum pairé? Quel est son utilité?

Answer 20

Un sérum pairé c’est quand on compare deux sérums provenant du même animal mais prélevés à des intervalles différents.
Sert à observer l’augmentation du tire d’Ac contre un virus donné et confère une valeur diagnostique au résultat.

Question 21

Quels types d’anticorps (Immunoglobulines) sont les plus fréquemment utilisés dans les techniques d’analyse et de dosage protéique ?

Answer 21

IgG

Question 22

Quel nom donne-t-on au site par lequel l’anticorps se lie aux protéines ?

Answer 22

Paratope (sur l’anticorps)

Question 23

Quel nom donne-t-on au site sur la protéine où se lie l’anticorps ?

Answer 23

Épitope

Question 24

Comment produit-on des anticorps polyclonaux ?

Answer 24

Ils sont obtenus suite à des vaccinations répétées (contenant l’antigène & l’adjuvant) chez un animal. L’adjuvant (protéine) stimule le système immunitaire de l’animal à former des anticorps dirigés contre l’antigène.

Question 25

Expliquez ce que signifie le terme anticorps polyclonaux (pourquoi polyclonaux) ?

Answer 25

On génère plusieurs anticorps (produits par de différents clones de lymphocytes B) qui sont tous dirigés contre la même protéine, mais à des différents épitopes dans le sérum final.

Question 26

Nommez deux désavantages possibles de l’utilisation des anticorps polyclonaux ?

Answer 26

Réaction croisée (quand un Ac reconnaît un épitope similaire sur une autre protéine) : pas spécifique pour détecter une seule protéine
Un Ac polyclonal sera épuisé lorsque l’animal meurt ou lorsque le sérum récolté est épuisé (incapable de se diviser en culture)

Question 27

• Quelle technique a-t-on développée:

a) pour contrer les désavantages de l’utilisation des anticorps polyclonaux ?

Answer 27

Les anticorps monoclonaux

Question 28

Pourquoi, en culture cellulaire, ne peut-on pas isoler individuellement les lymphocytes afin qu’ils puissent produire des anticorps à partir d’un animal ?

Answer 28

En culture, les lymphocytes B ne se divisent pas et meurent.

Question 29

Quels sont les avantages d’utiliser des anticorps monoclonaux par rapport aux polyclonaux ?

Answer 29

Ils produisent toujours le même anticorps (performe de façon identique dans les diverses techniques d’analyses)

Peuvent être produits en grande quantité et la lignée de cellules peut être congelée et décongelée selon les besoins.

Question 30

Nommez un désavantage de produire un anticorps monoclonal.

Answer 30

Ils sont plus longs à obtenir, coûtent plus cher et requièrent plus de compétences techniques que les polyclonaux.

Question 31

Nommez les avantages à utiliser la poule afin de produire des Anticorps

Answer 31

Raisons éthiques: pas besoin de saigner la poule pour obtenir les anticorps puisqu’ils se retrouvent dans le vitellus de l’œuf.