Geenitekniikka hyödyntää DNA:ta

Question 1

Mistä DNA:ta voidaan eristää?

Answer 1

DNA:ta voidaan eristää mistä tahansa solunäytteestä, mutta yleensä limakalvosta tai verinäytteestä

Question 2

DNA:n eristämisen vaiheet:

Answer 2

1. näytteen kerääminen
2. Solun hajottaminen (rasva-aineet liuotetaan sekä proteiinit ja RNA-molekyylit hajotetaan)
3. DNA:n puhdistus (proteiinit) ja saostus kylmällä alkoholilla
4. DNA:n eristäminen

Question 3

DNA:n eristäminen suodattimen avulla

Answer 3

1. Näytteen solut hajotetaan
2. Hajonneet solut siirretään pylvääseen
3. DNA sitoutuu pylvään suodattimeen
4. DNA:n irrottaminen suodattimesta

Question 4

mitkä entsyymit hajottavat proteiinit DNA:n eristämisen yhteydessä?

Answer 4

proteaasientsyymit

Question 5

Mitkä entsyymit hajottavat RNA-molekyylit DNA:n eristämisessä?

Answer 5

RNA-nukleaasientsyymit

Question 6

Mitä entsyymiä käytetään DNA:n monistamisessa?

Answer 6

DNA-polymeraasientsyymiä

Question 7

DNA:n monistamisen vaiheet solussa

Answer 7

1. helikaasientsyymi katkaisee emästen väliset sidokset -> DNA-juosteet erkanevat toisistaan (laboratoriossa kuumentamalla)
2. DNA-polymeraasi liittää DNA-nukleotidit emäsparisäänön mukaisesti juosteiden rinnalle

Question 8

Lyhyeiden DNA-alueiden monistusmenetelmä

Answer 8

polymeraasiketjureaktio = PCR-tekniikka

Question 9

pidempiden DNA-alueiden monistusmenetelmä

Answer 9

bakteerin plasmidin avulla

Question 10

PCR-tekniikkaan tarvikkeet ja aineet:

Answer 10

DNA-näyte, DNA-alukkeet, DNA-nukleotidit, DNA-polymeraasi, reaktioliuos, PCR-putki

Question 11

Selitä polymeraasiketjureaktion periaatteet:

Answer 11

• Monistaminen tapahtuu PCR-koneessa
• PCR-koneen koeputket lämmitetään:
  95-astetta - juosteet erkanevat
  55-astetta - DNA alukkeet sitoutuvat
  72-asteta - DNA-polymeraasi rakentaa uuden juosteen

Question 12

PCR-tekniikassa käytetyt DNA-alukkeet

Answer 12

• kaksi erilaista
• synteettisesti valmistetut DNA-palat
• rajaavat halutun alueen, jota halutaan monistaa sitoutumalla monistettavan alueen reunoille emäsparisäännön mukaisesti > DNA-polymeraasi sitoutuu alukkeisiin

Question 13

Mikä on kvantitatiivisen PCR:n (= qPCR:n) periaate?

Answer 13

Tekniikassa sekä monistetaan DNA että mitataan monistuvien kopioiden määrä

Question 14

qPCR:n vaiheet

Answer 14

1. Koetin (lyhyt yksijuosteinen DNA) sitoutuu tutkittavaan näytteeseen emäsparisäännön mukaisesti
2. Koettimeen sitoutunut leima (esim. fluoresoiva väriaine) lähettää fluoresenssia -> havainnoidaan koettimen sitoutumista/ fluoresoivat väriaineet lähettävät fluoresenssia sitoutuessaan DNA:han
3. Fluoresenssin voimakkuuden avulla saadaan selville DNA-kopioiden määrää

Question 15

miksi qPCR on nopeampi kuin PCR?

Answer 15

qPCR:n fluoresenssin avulla saadaan tietään kopioituneen DNA:n määrä välittömästi

Question 16

Miten qPCR:n avulla saadaan selville aktiivisena olevia soluja?

Answer 16

1. solusta eristetään lähetti-RNA-molekyylit
2. käänteiskopioijaentsyymin avulla tehdään vastin-DNA:ta (=cDNA:ta)
3. saadaan tietää aktiivisena olevat solut ja tuotettujen lähetti-RNA:n määrä

Question 17

vastin-DNA:n rakentamisvaiheet

Answer 17

1. käänteiskopioijaentsyymi rakentaa RNA-juosteen viereen DNA-juosteen
2. Käänteiskopioijaentsyymi hajottaa RNA-juosteen RNA-DNA-hybridistä
3. Käänteiskopioijaentsyymi rakentaa DNA-juosteelle vastinjuosteen

Question 18

DNA:n monistaminen bakteereissa

Answer 18

1. Monistettava alue leikataan irti DNA:sta katkaisuentsyymeillä (=restriktioentsyymeillä)
2. Plasmidi katkaistaan samoilla entsyymeillä
3. Monistettava DNA-alue liitetään plasmidiin liittäjäentsyymien (=ligaasientsyymien) avulla
   -> yhdistelmä-DNA-molekyyli
4. yhdistelmä-DNA-molekyyli siirretään bakteerisoluun keinotekoisella transformaatiolla
5. Antibioottivalinta, bakteereja kasvatetaan antibiootteja sisältävällä kasvatusmaljalla
6. bakteerisolujen kasvatusta jatketaan antibioottia sisältävässä kasvatusliemessä
7. Bakteerisoluista eristetään yhdistelmä-DNA-molekyyli

Question 19

DNA:n elektroforeesin periaate

Answer 19

selvitetään yksittäisten DNA:n molekyylien pituudet

Question 20

DNA:n elektroforeesin vaiheet

Answer 20

1. tutkittava näyte laitetaan agaroosigeeliin, joka kytketään sähkökenttään
2. negatiivisesti varautuneet DNA-molekyylit liikkuvat sähkökentässä kohti positiivista varausta
3. fluorisoiva väriaine sitoutuu näytteeseen -> tutkitaan DNA-näytteiden etenemistä
4. Mitä pidempi DNA-pala on, sitä hitaammin se liikkuu geelissä
5. elektroforeesin jälkeen leikataan irti haluttu pala