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Generalidades Flashcards

(69 cards)

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1
Q

Diferencia entre método clásico de Sanger y el automatizado

A

Clásico: son 4 tubos de reacción en donde en cada uno se pone un ddNTP distinto para que corra en distintos canales.
Resultados se ve en una autorradiografía.
Automatizado: en un mismo tubo se ponen los 4 ddNTPs porque cada uno tiene un fluorocromo distinto.
Se ven los resultados en un electroferograma.

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2
Q

¿Cuantos primers necesito en Sanger?

A

1 único primero pero se ponen muchas moléculas de ese mismo.

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3
Q

¿Cuantos primers necesito en PCR?

A

2 primers: uno forward y otro reverse.

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4
Q

¿Qué muestra el gel de agarosa en Sanger clásico?

A

Las marcas radioactivas de la hebra sintetizada.

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5
Q

Materiales para secuenciación clásica de Sanger

A 
4 tubos
DNA molde (el que quiero secuenciar)
dNTPs
ddNTPs ( 1 para cada base)
Primer (específico)
DNA polimerasa 
Buffer
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6
Q

Diferencia entre dNTPs

y ddNTPs

A

Los ddNTPs son nucleótidos hechos artificialmente en el lab. Carecen de OH en carbono 3´ que sirve para elongar cadenas.

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7
Q

En sanger automatizado se utilizan tubos diferentes para cada ddNTP?
Verdadero o falso y por qué?

A

Falso, se ponen los 4 ddNTPs en un mismo tubo de reacción. Se diferencian porque cada uno está acoplado a un fluorocromo.

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8
Q

¿En dónde corren los tubos en la secuenciación de Sanger clásica?

A

En una electroforesis de gel de agarosa

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9
Q

¿En dónde corren los tubos en la secuenciación de Sanger automatizada?

A

En una electroforesis capilar

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10
Q

¿Qué significa que te salgan 2 picos en el electroferograma en Sanger automatizado?

A

Que hay una mutación.

Eres heterocigoto para cierta base.

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11
Q

¿Qué es un “read”?

A

Fragmentos de DNA que se pueden secuenciar en un mismo experimento.

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12
Q

¿Qué hago con los reads obtenidos?

A

Un mapeo o alineamiento en donde comparo con el genoma de referencia.

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13
Q

¿Qué es un “Hit”?

A

Cuando un read hace match con el genoma de referencia

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14
Q

¿Qué es un “contig”?

A

Una serie de reads superpuestos que hacen un mapa más grande del DNA (forman fragmentos más grandes).

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15
Q

¿Qué me indica la cobertura?

A

Cuántas veces fue secuenciada cierta base (habla del nucleótido que más aparece).

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16
Q

Técnicas de NGS (next generation sequencing)

A

Pirosecuenciación
Fase sólida Illumina
Ion proton
Nanopore

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17
Q

Qué significa PCR

A

Reacción en cadena de la Polimerasa

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18
Q

Función de la PCR de punto final

A

Amplificar secuencias de DNA

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19
Q

¿La PCR puede secuenciar?

A

NO

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20
Q

¿Por qué se dice que es “en cadena”?

A

Porque los productos de un ciclo son los reactivos del siguiente ciclo.

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21
Q

Elementos para hacer una PCR

A 
Muestra de DNA
2 Primers (uno reverse y uno forward)
dNTPs
Taq polimerasa 
Buffer de reacción
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22
Q

¿Qué es la Taq polimerasa?

A

Una DNA polimerasa que viene de una bacteria y es resistente a altas temperaturas.

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23
Q

3 pasos que se repiten en cada ciclo de la PCR

A
  1. Desnaturalización
  2. Alineamiento
  3. Extensión
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24
Q

¿Qué voy a obtener al final de los 30- 40 ciclos de la PCR?

A

Pedacito de DNA amplificado muchas veces.

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25
Utilidad de PCR
- Detectar patógenos - Huella genética: genómica forense, pruebas de paternidad, identificación de cadáveres. - Hetero u homocigosis en inserciones o deleciones - Falsificación de fórmula alimentaria
26
¿Cómo se puede detectar el ADN del patógeno?
Se ponen un par de primers específicos de cierto virus. Si no está el virus, no se amplifica nada.
27
Límites de la PCR de punto final
Se debe conocer la secuencia que se busca amplificar (para diseñar los primers). Es una técnica cualitativa por lo que no te dice la cantidad de DNA en una muestra, sólo amplifica. No permite detectar SNP o inersciones y deleciones. Te da una repsuesta de sí o no (si lo que estas buscando esta presente o no).
28
3 Diferencias entre Sanger y PCR
Sanger secuencia, PCR amplifica. Sanger utiliza 1 único primer específico mientras que PCR utiliza 2 primers (reverse y forward). Sanger utiliza dNTPs y ddNTPs mientras que PCR sólo dNTPs.
29
Otro nombre para la PCR en tiempo real
qPCR
30
Funciones de la qPCR
- Me permite saber cantidad de DNA en una muestra. Ej: carga viral. - Determinar homocigosis y heterocigosis
31
Elemento que se usa en qPCR pero no en PCR normal.
Agente intercalante
32
¿Qué es un agente intercalante? ¿Cuáles se utilizan?
Es un oligonucleótido que emite fluorescencia conforme se amplifica el DNA. Ejemplos: Sybr Green y sonda TaqMAN
33
¿cómo funciona el Sybr Green?
Emite fluorescencia al unirse a la doble hebra del DNA.
34
¿Cuándo se puede ver la intensidad de la fluorescencia al usar Sybr Green?
Al final de cada ciclo. Al principio no se ve ya que hay desnaturalización de cadenas y estas van a estar separadas por lo que el Sybr Green no se pega y no emite fluorescencia.
35
¿Cómo se compone la sonda TaqMAN?
Extremo 5´:Fluorocromo | Extremo 3´: Quencher (absorbe la fluorescencia emitida)
36
¿A dónde se une la sonda TaqMAN?
Al medio de la cadena de DNA.
37
¿Cuándo se puede ver la intensidad de la fluorescencia al usar sonda TaqMAN?
Cuando estan separados el fluorocromo del quencher (después de formarse la cadena).
38
¿qué es el Umbral?
Intensidad de fluorescencia
39
¿Cuándo se detecta la fluorescencia?
A partir del umbral
40
¿qué es el ciclo crítico (Ct)?
El ciclo a partir del cual se presenta el umbral.
41
¿qué es la Tm?
Melting temperature. | Es la temperatura a la que estarán desnaturalizados la mitad de los amplicones
42
¿De qué depende la Tm?
- Longitud del fragmento - Secuencia - Cantidad de pares de Guaninas y Citosinas
43
¿Qué muestra la curva estándar?
La relación entre el Ct y la cantidad de DNA.
44
2 formas de cuantificar en qPCR
Cuantificación relativa | Cuantificación absoluta
45
¿Qué necesito en la cuantificación absoluta?
Curva estándar
46
Cuantificación relativa
No se necesita curva estándar, solo se comparan 2 muestras
47
¿Qué parámetro utilizo en cuantificación relativa?
La diferencia de Ct.
48
¿Qué parámetro utilizo para determinar homocigosis o heterocigosis?
Tm
49
¿Qué muestra un homocigoto en qPCR?
1 único tipo de amplicón
50
¿Qué muestra un heterocigoto en qPCR?
2 tipos de amplicones con distintas características. | En la gráfica, se ven 2 picos distintos que indican que tienen Tm´s distintas.
51
Diferencias entre PCR standard y qPCR
PCR standard: No permite cuantificar el DNA No utiliza agente intercalante Necesita Electroforesis qPCR: Cuantifica DNA Utiliza Sybr Green, sonda TaqMAN. Emite fluorescencia que permite ver la cantidad de DNA amplificado.
52
Cuándo utilizo RT qpcr?
Cuando tengo ARN viral.
53
Elementos de RT PCR
RNA Retrotranscriptasa inversa RNasa DNA polimerasa
54
Cambio importante al pasar de una cadena de RNA a DNA
Cambiar bases: de Uracilos a Timinas.
55
Señal medible de la pirosecuenciación
Luz
56
Señal medible de Sanger
Fluorescencia
57
¿En qué método utilizo adaptadores?
Pirosecuenciación
58
¿Cuántos adaptadores necesito y en dónde se colocan?
2 adaptadores, se unen a los extremos de los reads. | Son 2 por cada read y deben ser diferentes.
59
Función de adaptadores
Inmovilizar reads | Guiar la secuenciación
60
Etapas de la pirosecuenciación
1. Obtener la librería 2. Amplificación de secuencias 3. Secuenciación
61
Cuántas perlas nanoscópicas se ponen?
1 perla por cada read
62
¿Qué tenemos en la emulsión de agua y aceite (gotita)?
En la gotita, esta la perla unida a su read amplificado muchas veces.
63
¿Qué se coloca en cada pocillo?
- Perla con el read amplificado muchas veces - Enzimas: Luciferasa y Sulfurilasa - DNA polimerasa y 1 primer (complementario a el adaptador B).
64
¿Quien detecta la emisión luz en la pirosecuenciación?
Cámara CCD
65
¿Cuándo se emite luz en la pirosecuenciación?
Cuando se pega el nucleótido complementario a la cadena. Se forma el enlace fosfodiéster.
66
Explica cómo se emite la luz
Al formarse la unión fosfodiéster, se libera fosfato inorgánico que es utilizado por la Sulfurilasa para convertirlo en ATP. ATP sirve para convertir a la Luciferasa en Oxiluciferina que es la que emite la luz.
67
¿Qué se debe hacer en cada ciclo que empiece en la pirosecuenciación?
Se deben agregar la DNA polimerasa, el primer y las enzimas otra vez.
68
¿Cómo se llama la gráfica que se obtiene al terminar la pirosecuenciación?
Pirograma
69
¿Qué me permite ver la pirosecuenciación?
Determinar la secuencias de miles de reads ubicados en los 400,000 pocillos de la placa.

Genómica (1 decks)

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