Genetikk Flashcards
(160 cards)
1
Q
Bioinformatik Analayse von..
A
Genomics: vergleichende Analyse ganzer Genome (Evolutionsforschung, Pathogenitätsfaktoren)
Transkriptomics: Expressionsprofile aller Gene im Verlauf der Entwicklung, in verschiedenen Geweben, als Reaktion auf externe Reize, bei Infektionskrankheiten, bei Erbkrankheiten / Mutationen, etc.
Proteomics: Erfassung aller Proteine in verschiedenen Geweben und subzellulären Kompartimenten, etc.
Metabolomics: Erfassung aller Metaboliten
Interactomics: Erfassung aller Proteininteraktionen
2
Q
BLAST bedeutet
A
Rückseite
Basic Local Alignment Search Tool(Altschul et al., 1990)
Standardsuchprogramm (Suchalgorithmus) für Sequenzdatenbanken
sucht nach lokalen Übereinstimmungen (engl. alignment)
auf Sequenzebene (Nukleotide, Proteine/AS)
Abfrage per Web oder als e-mail
kann für lokale Anwendungen auf dem eigenen Computer
installiert werden (public domain)
3
Q
Verschiedene BLAST-Tools
A
blastp Vergleicht eine Aminosäuresequenz mit einer Proteinsequenz-Datenbank (1)
blastn Vergleicht eine Nukleotidsequenz mit einer Nukleotid-Datenbank (1)
blastx Vergleicht eine Nukleotidsequenz, übersetzt in allen Leserahmen mit einer Protein-Datenbank (6)
tblastn Vergleicht eine Proteinsequenz gegen ein Nukleotid- Datenbank, die dynamisch in allen Leserahmen übersetzt wird (6)
tblastx Vergleicht eine in alle 6 Leserahmen übersetzte Nukleotidsequenz gegen eine in alle 6 Leserahmen übersetzte Nukleotid-Datenbank (36)
4
Q
Was steht in einem BLAST-Ergebnis?
A
Tabelle mit kurzer Beschreibung aller Hits, sortiert nach aufsteigendem E-Wert
Darstellung jedes einzelnen Alignments der Suchsequenz mit der Vergleichssequenz (siehe unten)
Details zur prozentualen Identität und Ähnlichkeit, Score, E-Wert,Gaps
5
Q
Genomgrößen
A
Pflanzen: eine sehr größe spannbreite = zwischen 10^5- 10^8
Säuger: etwa 10 ^6
6
Q
1.1 )C-Value Paradox:
A
In Eukaryonten gibt es keine Korrelation zwischen der Komplexität des Organismus, der Größe des Genoms und der Zahl seiner Gene
7
Q
1.4.)Beispiel prokaryontische Genome
A
Escherichia coli K12
•Proteinkodierende Sequenzen folgen lückenlos aufeinander
• Promotoren sind klein
• keine Introns
* wenig repetitive DNA ( Transposons) –> IS-Elemente
–>Gene zählen ist in prokaryontischen Genomen relativ einfach
8
Q
1.6)Eukaryontische Genome: das Genom des Menschen
A
Das Humangenom: 2,9 x 10^9bp
- ca. 45% davon sind Transposons und Transposons-verwandte repetitive Sequenzen
- ca. 1,5% davon sind Exons (proteinkodierende, rRNA, tRNA)
9
Q
2.)Mechanismen der Genomevolution
A
(1) Aquisition neuer Sequenzen durch horizontalen Transfer von genetischem Material zwischen Organismen
a) Transfer von Plasmiden und chromosomaler DNA zwischen Bakterien
durch Konjugation (F Plasmid, Hfr Stämme)
b) Transfer von genetischem Material über Bakteriophagen (Transduktion)
und eukaryontische Viren (Retroviren)
c) Transponierbare Elemente im Zusammenwirken mit Vektoren (z.B. Milben)
(2)Rearrangement bereits vorhandener DNA Sequenzen führt zur Reorganisation des Genoms
a) Ungleiches Crossing-over durch Fehlpaarung während der homologe Rekombination
b)Nicht-reziproke Rekombination führt zu Genduplikationen.
Eine Genkopie behält die Funktion bei, die andere unterliegt
keinem Selektionsdruck und kann neue Funktionen evolvieren.
c)Transponierbare Elemente
10
Q
Transposons
A
Transposons sind
- ubiquitäre Genombestandteile
- natürliche biologische Mutagene
- Retroelemente (“Klasse I - Transposons”):
- DNA-Elemente (“Klasse II - Transposons”):
11
Q
3.1)Retroelemente (“Klasse I - Transposons”):
A
>transponieren über ein RNA-Intermediat >sind nur in Eukaryonten bekannt • Retroviren (Säuger) • Retrotransposons (Vertebraten, Pilze, Pflanzen) • Retrogene (Vertebraten, Pflanzen) -> stabile Mutation
12
Q
3.2.)DNA-Elemente (“Klasse II - Transposons”)
A
-transponieren durch DNA-Exzision und –Reintegration
-gibt es in allen Eubakterien, Archae und Eukaryonten
• temperente Bakteriophagen
• IS Elemente (Bakterien)
• Tn Transposons (Bakterien)
• Transponierbare Elemente (Vertebraten, Pilze, Pflanzen)
-instabile Mutation (reversibel)
13
Q
3.5.)Verbreitung von Antibiotika-Resistenzgenen durch
A
Verbreitung von Antibiotika-Resistenzgenen durch Transposons
–> Antibiotika-Resistenzgene kommen in der Natur als integraler Bestandteil in Transposons vor.
14
Q
5.)Die Aktivität von Transposons muss limitiert werden
A
Die Aktivität von Transposons muss limitiert werden
Transposon Insertionen lösen neue Mutationen in Genen aus
Die überwiegende Mehrzahl von Mutationen hat negative Auswirkungen
CO-EVOLUTION
Wirtsorganismen haben Mechanismen zur Kontrolle der Transposons evolviert
Transposons haben autoregulatorische Mechanismen evolviert
15
Q
5)Epigenetisches Silencing von Transposons im Wirtsgenom
A
Epigenetisches Silencing von Transposons im Wirtsgenom
• Amplifikation von TEs (vor allem Retrotransposons) ist hauptsächlich verantwortlich für Variationen der Genomgrößen eng verwandter Pflanzen (insbesondere bei den Gräsern)
• Die meisten Transposons im Genom werden nicht transkribiert:
Beispiel LTR-Retrotransposons in Mais: >70% Anteil im Genom,
<0.015% aller ESTs
• die Transkription von Pflanzen DNA-Transposons und LTR-Retrotransposons wird in einem zweistufigen Prozess epigenetisch über viele Zellgenerationen reprimiert:
(1) posttranskriptionelles Gene Silencing, PTGS
(2) Transkriptionelles Gene Silencing, TGS
16
Q
1.)Epigenetik - Definitionen
A
Chemische Modifikationen von DNA oder Histonproteinen, die die Aktivität von Genen regulieren.
Mitotische und meiotische „Vererbung“ von Informationen, die nicht in der DNA Sequenz fixiert sind.
Epigenetische Information besteht aus Markierungen der DNA und der Histone („epigenetic marks“)
Epigenetische Markierungen determinieren grundsätzlich den Aktivitätszustand von Genen.
Epigenetische Information ist instabil und temporär: sie kann über viele Zellgenerationen erhalten bleiben, führt aber nicht zu evolutionär dauerhaften Veränderungen
manche epigenetischen Informationen werden in bestimmten Entwicklungsstadien immer gelöscht
17
Q
1.1)Mechanismen der Epigenetik ( Ebenen)
A
(1) DNA Methylierung
(2) Histon Modifikationen
(3) „RNA directed DNA methylation“ (RdDM)
18
Q
2.)DNA Methylierung Bei Eukaryonten und Prokaryonten
A
Rückseite
DNA Methylierung
Eukaryonten: fast ausschließlich Cytosin -Methylierung ( 5mC)
Prokaryonten: überwiegend Adenin - und seltener Cytosin-Methylierung
• Die CH 3-Gruppen von Adenin- und Cytosin-methylierter DNA ragen in die große Furche des DNA-Doppelstranges und verändern dadurch die Zugänglichkeit der Basen für DNA-bindende Proteine.
19
Q
2.1)DNA Methylierung in Eukaryonten
A
- Der Anteil methylierter Cytosine im Genom variiert in verschiedenen Arten stark.
- In allen Eukaryonten werden Cytosine abhängig vom Sequenzkontext methyliert.
- Am stärksten methyliert ist immer das C in der Sequenz 5’- CG -3’(“CpG”)
20
Q
2.2)Funktionen der DNA Methylierung
A
1) Bakterien nutzen DNA Methylierung als unspezifisches „Immunsystem“ zum
Schutz gegen Viren (Bakteriophagen)
»Bakterielle „Restriktions-Modifikations-Systeme“
Ein Restriktionsenzym R zerschneidet nur unmethylierte DNA.
Die eigene chromosomale DNA wird durch eine Methylase M methyliert
und so vor dem Zerschneiden geschützt
»DNA-Methylase HhaI :
methyliert ein Cytosin (!!) in der Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms
Hha I und schützt diese Sequenz so vor dem Zerschneiden
(2) Unterscheidung des Template-Strangs und des neusynthetisierten Strangs bei der semikonservativen Replikation
ist notwendig bei der
Reparatur von fehlgepaarten Basen durch das Mismatch Reparatur Systems (MMR)
(3) Regulation der Aktivität von Promotoren
»Methylierung von Cytosinen im Promoter verhindert die Bindung von Transkriptionsfaktoren.
• In ~70% aller Säuger-Promotoren finden sich stark gehäuft CpG Sequenzen - sog. “CpG-islands”
21
Q
2.4.)DNA Methylierung Beispiele
A
- X-Chromosom Inaktivierung:
Alle Organismen mit einem XX/XY- oder XX/X0-Geschlechtschromosomen
System für die Sex-Determination benötigen einen Mechanismus zur
Dosiskompensation der Aktivität von X-gekoppelten Genen
Bei Säugern wird auf einem der beiden X-Chromosomen der „X inactive-specific transcript“ Locus XIST im „X inactivation center“ XIC exprimiert.
Das XIST-Transkript ist eine 17 kb lange nicht-codierende RNA (lncRNA), die im Zellkern verbleibt und nur an das X-Chromosom bindet von dem sie transkribiert wird!
Dieses X-Chromosom wird kompaktiert und zum „Barr- Körperchen
Während der XInaktivierung wird die XChromosomen DNA nahezu vollständig Cmethyliert (5mC)
In der Zygote sind beide Xromosomen aktiv und unmethyliert.
In der frühen Embryogenese wird zufällig eines der beiden X-Chromosomen inaktiviert.
–>Weibliche Individuen sin somatische Mosaike(Mosaizismus)»_space; Vorteil - Imprinting
Imprinting („Prägung“): der epigenetisch in Form von DNA-Methylierung determinierte Aktivitätszustand eines Gens unterscheidet sich in den maternalen und paternalen Gameten und wird an die Zygote vererbt
»Imprinting tritt in Säugern und höheren Pflanzen auf.
»In Säugern werden etwa 1% aller Gene mit einem Imprinting-Muster vererbt.
22
Q
2.5.)DNA-Methylierung im Bienenstaat
A
DNA-Methylierung im Bienenstaat
Was unterscheidet die Königen und Arbeiterinen?
>Gene Gleich
>Königen wird mit Gelee Royale gefüttert, das führ t zu epigenetischen Veränderungen
Daraus folgt:
>Ernährung kann epigenetische Muster beeinflussen
23
Q
3.)Histon Modifikationen
A
Der Nucleosomen-Kern besteht aus Histonproteinen (Heterooctamer).
Die N-Termini der Histone ragen aus Nucleosomen heraus.
Chemische Modifikationen der Histon N-Termini beeinflussen die transkriptionelle Aktivität der assoziierten Gene.
Histon Modifikationen regeln den Aktivitäts zustand von Chromatin
24
Q
3.1.)Die Histon Code Hypothese
A
Die Art und Kombination der Histonmodifikationen an bestimmten Aminosäureresten der Histon N-Termini determinieren den Aktivitätszustand von Chromatin.
Der Histon-Code wird von anderen Proteinen „ausgelesen“ und in zelluläre Vorgänge übersetzt.
25
3.2.)Histon Modifikations-Dynamik am Arabidopsis FLC Locus
Der Arabidopsis
>>Flowering Locus C ( FLC ) ist ein negativer Regulator der Blütenentwicklung.
>>Aktivierung und Silencing des FLC Gens wird durch Chromatin-Modifikationen reguliert.
26
4.)RNA-vermittelte Genregulation
1. siRNA
2. miRNA
3. lncRNA (Bsp. XIST s.o.)
27
4.2)RNA-vermittelte Genregulation
| Was sind small RNAs?
* Small RNAs sind 21 bis 25 nt kurze RNAs heterogenen Ursprungs die ein Ausschalten von Genen bewirken (‘gene silencing’)
* Small RNAs tragen zum ‘posttranscriptional gene silencing’ (PTGS) bei indem sie die mRNA Stabilität oder die Translation beeinträchtigen.
• Small RNAs tragen zum ‘transcriptional gene silencing’ bei indem sie epigenetische DNA- und Chromatinmodifikationen auslösen.
28
5.) Dicer (The molecular architecture of human Dicer)
schneidet und kürzt doppelsträngige DNA
29
7.)siRNA (short interfering RNA):
Rückseite
siRNA (short interfering RNA):
• 21-22(-30) nt dsRNA
• werden durch "Dicer" aus längeren doppelsträngigen RNAs verschiedenen Ursprungs prozessiert
• ein Strang dieser kurzen dsRNA wird vom RISC Multiproteinkomplex rekrutiert
• siRNA-RISC löst die Degradierung perfekt komplementärer mRNAs aus
30
8.) miRNA (microRNA):
miRNA (microRNA):
• 19-25 nt ssRNA
• wird von den MIR Genen exprimiert, die in den Genomen der meisten Vielzeller vorkommen (>200 MIR Gene im Genom des Menschen)
• wird durch "Drosha“, "Dicer" und „Argonaut“ Proteinen aus den partiell doppelsträngigen MIR Transkripten prozessiert (Pri- und Pre-miRNAs)
• ein Strang wird vom RISC Multiproteinkomplex rekrutiert
• miRNA-RISC blockiert überwiegend die Translation der zellulären Zielgene
-->Viele miRNAs sind hoch konserviert und wichtige Genregulatoren
2/3 aller miRNA Zielgene in Arabidopsis sind selbst regulatorische Gene( transkrioption,Proteinabbau, Gensilencing)
31
Analyse von Plasmid‐DNA
| Welche Möglichkeiten gibt es?
a) PCR – Amplifikation eines DNA‐Abschnittes
‐ Oligonukleotide/Primer werden benötigt
‐ wenn nur Vektor‐Sequenz bekannt ist, kann man nur die Größe des inserts bestimmen
‐ kloniert man eine bekannte DNA‐Sequenz, kann man mittels spezifischer Primer das Vorhandensein/Position dieser spezifischen DNA im Vektor überprüfen
b) Restriktionsverdau
‐ wenn nur Vektor‐Sequenz bekannt ist, kann man nur die Größe des inserts bestimmen bzw. Aussagen über vorhandene Schnittstellen treffen
‐ kloniert man eine bekannte DNA‐Sequenz, kann man mittels spezifischer Endonukleasen das Vorhandensein/Position dieser DNA im Vektor anhand der erwarteten Fragmentgrößen überprüfen
c) Sequenzierung
‐ Oligonukleotide/Primer werden benötigt
‐ man kann aus dem Vektor in das insert „hineinlesen“, um
‐> die Sequenz zu identifizieren
‐> den reading frame zu überprüfen (z.B. für Proteinexpression)
‐> die Sequenz auf Mutationen zu überprüfen
(z.B. Mutagenese)
32
VORTEILE UND NACHTEILE (PCR, Restriktionsverdau, Sequenzierung)
PCR
Vorteile
• schnell: als template dienen Kolonien, Kulturen oder (geringe) Mengen an DNA
• Durchsatz: screening möglich
Nachteile
• Aufwand: es werden Oligonukleotide benötigt (spezifisch für Vektor oder Insert)
• Einschränkung: große Fragmente können Probleme bereiten
Restriktionsverdau
Vorteile
• Durchsatz: screening möglich
• preiswert: Enzyme können für viele Vektoren etc. verwendet werden
Nachteile
• Aufwand: DNA muß zunächst in ausreichender Menge extrahiert werden
Sequenzierung
Vorteile
• maximale Information
Nachteile
• Aufwand: DNA muß zunächst in ausreichender Qualität extrahiert werden, Oligonukleotide nötig
• Kosten: meist externer Dienstleister
33
Plasmid‐Extraktion / Minipräp
| alkalische Lyse nach Birnboim & Doly, 1979
Bakterien in stationärer Phase (ÜN‐Kultur) werden durch Zentrifugation aufkonzentriert und dann durch ein alkalisches Millieu (pH ~12) die Zellwände aufgebrochen und Proteine+DNA denaturieren.
P1: Tris, EDTA, RNase
P2: NaOH, SDS
Kalium‐ oder Natriumactetat (pH 5) neutralisiert den Ansatz, und chromosomale DNA und Proteine gehen Komplexe mit K+ und Na+ Ionen ein (Ausfällung). Die Plasmid‐DNA bleibt (länger) in Lösung bzw. renaturiert schneller (reannealing).
Die Plasmid‐DNA wird durch Zugabe von Isopropanol gefällt (Entzug der Hydrathülle) und kann nun abzentrifugiert werden. Eine kurze Fällung bei auf Eis verhindert Salzausfällung (inhibierend z.B. bei Restriktionsverdau)!
Das DNA‐Pellet wird mit 70% Ethanol gewaschen und anschließend in Wasser oder TE‐Puffer (Tris‐EDTA) gelöst.
34
Agrobakterien: "Natürliche" Gentechnik?
Agrobakterien sind gram‐negative Bodenbakterien, die durch Integration bakterieller DNA ins Pflanzengenom eine Tumorbildung auslösen.
Das Bakterium besitzt ein extrachromosomales Ti‐Plasmid (Tumor induzierend). Dieses trägt neben dem Replikationsursprung (ori) die Virulenzgene (vir), die Transfergene (tra), die T‐DNA (onc, ops) und Gene für den Opinkatabolismus.
Die T‐DNA (zwischen left border und right border) wird in die Pflanzenzelle eingeschleust und ins Genom eingebaut.
In Bakterien mit entwaffnetem Helfer‐Plasmid wird ein binärer Vektor eingebracht, der die T‐DNA mit einzuschleusender DNA (gene of interest) trägt. Die Vir‐Region des Helfer‐Plasmids bewirkt in trans die T‐DNA Übertragung >> binäres System.
35
Der Weg zur transgenen Pflanze
…durch Agrobaterien‐vermittelte Transformation
Die gewünschte Sequenz (z.B. orf) wird in einen geeigneten Vektor (Plasmid) kloniert
‐Plasmid in E. coli Bakterien vervielfältigt
‐Überprüfung der Sequenz
‐Klonierung in binären Vektor (T‐DNA ca. 4 kb)
Binärer Vektor wird in Agrobakterien (A. tumefaciens) vervielfältigt.
Agrobakterien werden zur Transformation pflanzlicher Keimzellen verwendet (indirekter Gentransfer).
Samen der transformierten Pflanzen (T0) werden auf Selektionsmarker getestet, wie
z.B. eine Antibiotika‐ oder Herbizid‐Resistenz
‐entstehende transgene Pflanzen heißen T1
‐Test auf Anzahl der T‐DNA Insertionen (Segregationsanalyse)
Ziel: homozygote transgene Linien
36
stabile Transformation von A. thaliana
DNA Sequenz in binärem Vektor :
‐LB und RB (T‐DNA) mit Promotor/Gen/Terminator und Selektionsmarker
‐Replikationsstart (ori) und Selektionsmarker für E. coli und A. tumefaciens
Um eine stabile Transformation zu erreichen, müssen Keimzellen transformiert werden.*
Die Blüten/Keimzellen werden in Kontakt mit Agrobakterien gebracht. Nur Blüten in bestimmter Entwicklungsphase sind kompetent.
37
Extraktion genomischer Pflanzen‐DNA
Die Pflanzenzellen (Zellwand, Zellmembran) werden mechanisch durch schnelles Schütteln in Gegenwart einer Stahlkugel und Extraktionspuffer aufgebrochen.
‐Extraktionspuffer: Tris‐HCl, EDTA, NaCl
Die Zugabe von SDS bewirkt die Fällung von Lipiden und Proteinen, so dass Zelltrümmer, Lipide und Proteine abzentrifugiert werden können. Zügig arbeiten – genomische DNA beginnt zu denaturieren!
Die Nukleinsäuren werden durch Zugabe von Isopropanol gefällt und können nun abzentrifugiert werden.
Das DNA‐Pellet wird mit 70% Ethanol gewaschen und anschließend in Wasser gelöst
38
Nachweis von Transgenen per PCR
PCR auf T‐DNA spezifische Sequenzen, wie z.B.:
‐Selektionsmarker (Antibiotikum‐, Herbizidresistenz)
‐Promotor
‐Epitop
Tabakpflanzen segregieren für Hygromycin (HPT)/Tet bzw. Kanamycin (NPT)/GUS
39
1)DNA in Eukaryonten und Prokaryonten
Eukaryonten: Das Kerngenom der besteht i.d.R. aus mehreren linearen
Chromosomen
Prokaryonten haben meist ein zirkuläres Chromosom.
Die plastidären und mitochondrialen Genome sind zirkulär.
40
2)Warum ist die DNA in Chromosomen verpackt? Zweck?
Verdichtung der DNA zu kompakten Einheiten
Schutz der DNA vor Schädigung
korrekte Verteilung der DNA bei der Zellteilung an die Tochterzellen
Mechanismen zur (In)Aktivierung derDNA; Regulation der Genaktivität
41
3) Nucleosomen
Proteinkern aus Histonen
| 1,5 Umwindungen des DNA-Doppelstrangs
42
4)Histon-Oktamer
Kern der Nucleosomen
Besteht aus 4 verschiedenen Histonen : H2A H2B H3 H4
N-Termini ragen aus dem nuclesomen raus
Spielt eine große rolle bei epigenetischen Regulationen
43
5) H1-Histon
Lagert sich an Nucleosomen und verdichtet die Nucleosomen-Kette
von 10nM.Faser --> zu 30 nm Faser (Solenoide)
44
Chromsomen
Nucleoproteinkomplexe
Bestehen aus 2 Chromatiden die am Cetromer gebunden sind
Chromatid besteht aus Chromatin --> Nuclesomen
45
7)Wann sind Chromosomen sichtbar
Während der Metaphase der Zellteilung -> hochkonserviert
| interphase -> aufgelockert
46
Was ist Cohesin
Cohesin, ein evolutionär sehr alter Proteinkomplex,
bildet ein Skelett für Chromosomen im Interphasekern und stabilisiert deren Struktur.
Cohesin bildet eine Struktur zur Organisation der Chromosomen
47
9)Heterochromatin und Euchromatin
Euchromatin: mit Feulgen-Reagenz schwach färbbare Bereiche =
aufgelockerte DNA; enthält die meisten aktiven Gene
Heterochromatin: intensiv färbbare Chromosomenabschnitte = stärker
kondensierte DNA; wenige aktive Gene
48
repetetive DNA
DNA-Bereiche im Erbgut , deren Sequenz aus sich wiederholenden Abschnitten besteht.
Große Genome enthalten viel "repetitive DNA"
Der Anteil repetitiver DNA am Genom unterscheidet sich bei verschiedenen Organismen
in mittlerer bis sehr hoher Kopienzahl vor (bis >hunderttausend Kopien), die nicht für
Proteine kodieren („hochrepetitive DNA") – insbesondere im Heterochromatin.
Repetitive DNA hat häufig überhaupt keine oder zumindest keine essentielle
Funktion für den Organismus; neuere Ergebnisse zeigen aber, dass große
Abschnitte dieser DNA auch transkribiert werden
49
Genomik
Der Begriff „Genomik“ beschreibt die Untersuchung des gesamten Genoms eines Organismus, in erster Linie anhand der DNA Sequenz.
Genomweite Analysen beinhalten auch die Untersuchung aller Transkripte (Transcriptomics), Proteine (Proteomics), ihre Interaktionen (Interaktom) und ihrer Funktionen (Funktionelle Genomik).
50
9.2.2.)Hochdurchsatztechnologien sind für genomweite Analysen essentiell:
‐ Analyse der Genomsequenz – Next Generation Sequencing (NGS).
‐ Genomweite Analyse der Transkriptabundanz von Genen (Microarrays, RNA‐Seq).
‐ Genomweite Analyse von Protein‐DNA Interaktion (ChIP‐Seq).
51
9.2.3.)Informationen aus der Genomforschung
Die detaillierte Größe und Struktur des Genoms, zum Beispiel der Verteilungder Gene auf den Chromosomen.
Einblick in die Entwicklungsgeschichte von Genomen, zum Beispiel die Entdeckung früherer Genomduplikationen.
Vergleich der Genome verwandter Spezies: Regionen mit Kolinearität (Syntänie) und Entdeckung von speziesspezifischen Genen.
Analyse des Informationsgehalts eines Genoms, zum Beispiel Informationen über Art und Anzahl der proteinkodierenden Gene.
Informationen über die genetische Variabilität innerhalb einer Spezies.
Entwicklung molekularer Marker für die Kartierung von Genen und Merkmalen.
52
9.3.) Arabidopsis thaliana
Modellpflanze der Genetik und Genomforschung
• Erste komplett sequenziertes Pflanzengenom
• Genomegröße ca. 125.000.000 Bp
• ca. 27.000 Gene
53
9.3.1) Vorteile der Modellpflanze Arabidosis thaliana für den Experimentator
* Kleines Genom mit wenig repetitiven Sequenzen
* Genomische Sequenz bekannt
* Große Sammlungen von Mutanten incl. Knockout-Mutanten (T-DNA Insertionsmutanten)
* Hohe natürliche Variabilität bei Ökotypen (Akzessionen)
* Einfach genetisch transformierbar
* Hohe Anzahl von Nachkommen
* Kurze Generationszeit
* Geringer Platzbedarf
54
Paraloge Gene
| Ursache zur enstehung
Genduplikation (entstehen durch Duplikation eines Gens )
Polyploidie--> Homöloge gene enstehen
sagen etwas über die evolutive entwicklung was aus
55
Genomanalyse von Arabidopsis thaliana: statistische Daten
Genomgröße ca. 125 Mbp,
Anzahl Gene ca. 27.000 (1 Gen/4.5 kbp)
Ca. 60% der Gene gehören einer Genfamilie an und ca. 60% des Genoms besteht aus duplizierten Regionen
14% des Genoms besteht aus repetitiven Sequenzen, überwiegend Transposons
• 70% der Gene hat eine aus der Sequenz abgeleitete mögliche Funktion,
d.h. >7000 Gene haben keine bekannte mögliche Funktion
• Einige Genfamilien fehlen in Pflanzen, z.B. Tyrosinkinasen und Steroidhormonrezeptoren
Große Genfamilien sind der der Regulation der:
Proteinabbaus
Zellwandsynthese
Transkription,
56
)Drei verschiedene Ontologien werden derzeit benutzt:
* Molekulare Funktion (~ 8.500 Begriffe): z.B. Kinase, Phosphatase, usw.
* Biologischer Prozess (~15.000 Begriffe): z.B. Proteinsynthese, Ca-Bindung, usw.
* Zelluläres Kompartiment (~2.200 Begriffe): z.B. Zellkern, Vakuole, usw.
57
9.4.) Evolution des Kerngenoms At
```
Sehr viele (bis zu ca. 25%) der Kerngene von Arabidopsis (und allen anderen
Landpflanzen) stammen von Cyanobakterien ab – ein weiterer Beleg für die
Endosymbionten-Hypothese.
```
58
Allopolyploide
Allopolyploide Pflanzen enthalten zwei Chromosomensätze (AABB) aus
verschiedenen, nah verwandten Arten (AA und BB), die miteinander
gekreuzt wurden. Beispiele sind Raps, Tabak und Weizen.
59
Autopolyploiden
Bei autopolyploiden Pflanzen (AAAA) wurde der arteigene Chromosomensatz verdoppelt. Autopolyploidie kann durch Colchicin
(Inhibitor der Kernspindel bei der Mitose) induziert werden, dies verursacht meist ein Vergrößerung des Zellvolumens.
60
9.5.3.)Homologe Chromosomen und Homöologen Chromosomen bei der meisose
Homologe Chromosomen polyploider Pflanzen können in der Meiose korrekt miteinander paaren.
Bei homöologen Chromosomen sind die Sequenzunterschiede für eine Paarung zu groß.
61
9.5.4.) Züchtungsgeschichte des Weizens (Triticum aestivum)
Weizen gehört neben Mais und Reis zu den wichtigsten Nutzpflanzen.
Das Genom ist ca. 17 GBp groß (sechsmal so groß wie das des Menschen) und enthält sehr viel repetitive DNA.
Die Zuordnung der Sequenzen zum A, B und D Genom ist wegen der Sequenzähnlichkeit schwierig.
Eine erste Fassung der Genomsequenz liegt nun vor (Science, Juli 2014)
62
Untersuchung der Genfunktion durch die Änderung der Genaktivität.
```
Loss-of-function:
• Gen-Knockout
• Gen-Silencing (z.B. RNAi)
• TILLING
Gain-of-function:
• Ektopische Expression
• Dominante Mutationen
Verursacht die Mutation von Genen einen veränderten Phänotyp, so ist
dies sehr informativ über den zellulären Prozess an dem diese beteiligt sind.
```
63
Zukünftige Entwicklungen
| Weitere Fragen der Genomforschung
Die vergleichende Analyse von Pflanzengenomen wird dabei helfen, eine Reihe wichtiger Fragen der Pflanzenevolution zu beantworten, z.B. hinsichtlich der funktionellen Änderungen und Anpassungen während der Evolution.
Welche Änderungen geschahen als Pflanzen multizelluläre Organismen wurden?
Welche Änderungen begleiteten den Wechsel von Pflanzen aus dem wässrigen Milieu aufs Land? Wurden existierende genetische Programme angepasst, um Blüten und Vaskulargewebe zu bilden? Oder wurden neue Programme entwickelt?
Was war die Rolle der häufig aufgetretenen wiederholten Genomduplikation in verschiedenen Arten? Hat dies die massive Zunahme neuer Formen und Funktionen erst ermöglicht?
Welche Änderungen erfolgten bei der Domestikation von Nutzpflanzen?
Kann der vorhandene Genpool besser kombiniert werden für bessere Eigenschaften von Nutzpflanzen?
64
orthologe Gene
```
sind am nächsten verwandten Gene
gleicher Funktion
aus zwei verschiedenen Arten.
Untergruppe von homologen Genen
Enstehen durch Gen-duplikation
```
65
Welche Fragestellungen können mit transgenen Pflanzen untersucht werden?
Einbringung von Fremdgenen um ihre Funktion in planta zu untersuchen
Gain-of-function Analyse
Loss-of-function Analyse
Welche DNA Elemente müssen kloniert werden?
1)Protein-kodierende Region
2)Promoter (konstitutiver oder induzierbarer)
3)Selektionsmarker (z.B. Antibiotikaresistenz)
Welche Vektoren werden dafür verwendet?
–Pflanzenvektoren (Binäre Vektoren)
–Chloroplastentransformation (Gold-particle-gun)
66
Promotoren in transgenen Pflanzen --Wichtige Faktoren der Promotoren sind dabei:
–Stärke der Expression
–Gewebsspezifität
Dies kann durch einen geeigneten Promoter,der der Protein-kodierenden Regionvorangeschaltet wird bestimmt werden.
67
Induzierbares Expressionssystem
- Ausnutzung von Promoteren (regulatorischen Elementen) von “nicht-Pflanzen” Organismen (E.coli, Hefe oder Mensch)
- Promoteren die durch spezifische Chemikalien aktiviert werden –Inducer
- ->Chemisch regulierte Genexpression
68
Voraussetzungen für ein induzierbares System
```
Inducer
muss hochspezifisch für den Zielpromoter sein
Nicht-toxisch für Pflanzen
Einfache Applikation
Sollte das Gewebe penetrieren
billig
Promoter(regulatorische Sequenz)
Niedriger basaler Expressionslevel
Hohe Expression nach Induktion
```
69
Induzierbares Expressionssystem_-_Expression von zwei Genen in transgenen Pflanzen
1)Transkriptioneller Repressor oder Aktivator
(Gen, welches für das regulatorische Protein codiert)
2) Zu untersuchendes Gen unter der Kontrolle eines geeigneten Zielpromotors
70
Ethanol-induzierbares System
Ethanol bindet an den Alkohol-regulierten Transkriptionsfaktor (AlcR)
induziert eine Änderung der Konformation in AlcR
AlcR kann an den AlcA Promoter binden und nachgeschaltetes Gen aktivieren
71
Tetrazyklin-induzierbares System
Tetrazyklin Repressor-basierend,
Gram-negative Bakterien (E.coli) –Tetrazyklin Repressor (TetR) reguliert die Expression seines eigenen Gens (tetR) als auch die Expression des Tc Resistenzgens tetA.
TetR bindet an zwei tetOperatoren, was zur Repression von beiden Genen führt
Die Induktion basiert auf der Bindung von Tetrazyklin tc an tetR ->TetR-tc Komplex kann nicht mehr an die DNA binden
72
Reportergen-System. Beispiele für reporter gene und Funktion.
1.GUS (uidA) Gen
2.Green fluorescent protein (GFP)
3.Luciferasegen
Funktion: Erlaubt die Beobachtung von Vorgängen in Organismen:
Lokalisation bestimmter Proteine
Regulation von Genen
73
ß-Glucuronidase Gen (uidA, GUSGen)
Rückseite
Aus E.coli
In der Pflanzenmolekularbiologie als Reportergen genutzt um die Aktivität von Promotoren zu untersuchen
Kodiert für ein Enzym, welches schon in sehr niedriger Konzentration eine farblose Substanz in ein farbiges Präzipitat umwandeln kann, wenn das Substrat zugefügt wird.
1)Quantitativefluorometrische Messung
2)HistochemischeCharakterisierung eines Expressionsmusters
-->Zellen in denen der Promotor aktiv ist werden blau gefärbt, während andere farblos bleiben
74
Green fluorescent protein (GFP)
Rückseite
Protein der Leuchtqualle (Aequorea victoria)
Viele strukturelle Varianten des Gens erhältlich
z.B. rot oder gelb leuchtende Varianten (RFP, YFP)
GFP funktioniert in vielen heterologen Zelltypen (d.h. hat keine großen Anforderungen bezügl. Cofaktoren, oder posttranslationarer Modifikationen)
Lebendfärbung (z.B. Transportvorgänge können sichtbar gemacht werden.)
Nachteile:
Fluoreszenzmikroskop (teuer)
Autofluoreszenz von Chlorophyll in ähnlichem Bereich
75
Luciferase (luc) gene
Nordamerikanisches Glühwürmchen (firefly) entlässt grünes Licht während der Oxidation des chemischen Substrates Luciferin
Modifiziertes Protein LUC+ leuchtet stärker und ist cytoplasmatisch lokalisiert im Gegensatz zum nativen LUC, welches in Peroxisomen lokalisiert ist.
Schwachlichtkameras können die Biolumineszenz mit hoher Sensitivität auch in lebenden Organismen detektieren man kann bewegte Vorgänge darstellen.
Nachteil:
Luciferin muss zugegeben werden.
Teure Schwachlichtkameras
76
Abweichungen von den Mendelschen Regeln,
| jeweils mit Bezug zur Molekularbiologie
Multiple Allelie
Kodominanz
Letalfaktoren
Geschlechtsgebundene Vererbung
77
Wechselwirkungen zwischen allelen Genen
```
Dominanz
Unvollständige Dominanz
Kodominanz
Multiple Allelie
Letalfaktoren
(Hemizygotie: Geschlechtsgebundene Vererbung
```
78
Wechselwirkungen zwischen nicht allelen Genen:
Modifizierer
Gene, die den Phänotyp (i.d.R. quantitativ) leicht modulieren
Polygenie/ Redundanz
mehrere Gene sind für eine Merkmalsausprägung verantwortlich
zwei Mutationen in zwei Genen sind nötig für einen veränderten Phänotyp.
Epistasie(bremsen, stoppen)
eine Mutation in einem Gen verhindert (unterdrückt) die Ausprägung einer Mutation in einem anderen (nicht-allelen) Gen.
Expressivität
eine Mutation in einem Gen prägt den Phänotyp mit variablem Grad
Penetranz
eine Mutation in einem Gen prägt sich nicht in allen homozygoten Genträgern aus Wechselwirkungen zwischen nicht allelen Genen
Pleiotropie(Polyphänie)
eine Mutation in einem Gen bedingt eine mehrfache Veränderung im Phänotyp (multiple phänotypische Effekte)
79
Dominante/rezessive Mutationen
Fall 1: Die Produktion des ‘Wildtyp’-Proteins istausreichend(Schwelleneffekt), um den ‘Wildtyp’-Phänotyp auszuprägen:
rezessiveMutation (Das Wildtyp-Allelist ‘haplo-sufficient’ und somit dominant.)
Fall 2: Die Produktion des ‘Wildtyp’-Proteins ist nichtausreichend(Schwellenwert wird nicht überschritten), um den ‘Wildtyp’-Phänotyp auszuprägen:
dominanteMutation (Das Wildtyp-Allelist ‘haplo-insufficient’ und somit rezessiv.)
80
Kodominanz: beispiel
Hämoglobine und Sichelzellenanämie
Sichelzellenanämie wird verursacht durch das Sichelzellenhämoglobin (HbS), eine mutierte Form der der ß-Hb-Kette mit einer Glu -->Val Aminosäuresubstitution.
In Homozygoten nehmen die roten Blutkörperchen bei O2-Mangel eine sichelförmige Gestalt an.
Homozygote Träger sterben meist im Kindesalter.
Heterozygotesind meist symptomfrei und haben eine normale Lebenserwartung (unvollständig dominanter Phänotyp). Die Malariaresistenz ist erhöht (Selektionsvorteil!).
Die Expressionder Hämoglobinallele in Heterozygoten ist dagegen kodominant("molekularere Phänotyp"):
81
Multiple Allelie
"Multiple Allelie" ist das Vorkommen von mehr als zwei Allelen eines Gens in einer Population.
Jede neu auftretende Mutation in einem Gen stellt ein weiteres Allel dar, auch wenn diese Mutation keinen neuen Phänotyp bewirkt
„Multiple Allelie“ ist daher der Normalfall.
Beispiel :Phenylketonurie (PKU)
82
Kodominanz
beide Allele setzen sich vollständig durch: die Folge ist ein neuer Phänotyp
Beispiel: das AB0 Blutgruppensystem
83
Letalfaktoren
Letalfaktoren sind entdeckt worden als rezessive Allele, die im homozygoten Zustand letal sind
in heterozygoten Individuen keinen Phänotyp (Ausnahmen)
Letalität kann bereits in der Embryonalentwicklung auftreten
(Beispiel: Manx Gen bei Katzen, Yellow Gen)
oder erst in späteren Lebensjahren
(Beispiele: Cystische Fibrose, Duchenne Muskeldystrophie)
84
Letalfaktoren
| Unterteilung nach:
Unterteilung nach:
letal, subletal/semivital (wenn der Letalfaktor nicht immer voll zur Ausprägung kommt. Ein Teil der Letalfaktoren folgt also nicht dem „alles oder Nichts“-Prinzip, sondern es gibt eine Variabilität in der Ausprägung)
rezessiv(können vererbt werden), dominant(können im Normalfall nicht vererbt werden, sondern entstehen aus Neumutationen)
autosomal, gonosomal
Gametisch, gonisch, haplophasisch--zygotisch
85
Beispiel für einen gametischen (gonischen) Letalfaktor
Rückseite
Levkoje (Matthiola incana):
•Pflanzen mit gefüllten Blüten sind steril. Heterozygote Pflanzen (einfach blühend) bilden nach der Selbstung jedoch Nachkommen im Verhältnis 1:1 statt 3:1.
Erklärung durch einen (gonischen, pollenspezifischen) Letalfaktor, der eng mit dem Merkmal ‘gefüllte Blüte’ gekoppeltist (Rekombinationsfrequenz <1%).
In der Nachkommenschaft erhält man also nur heterozygote einfach blühendeNachkommen und sterile homozygote Nachkommen mit gefüllten Blüten (1:1).
86
Klonierung von DNA -Fragmenten
Eine Klonierung ist die Einführung eines DNA -Fragments in einen Vektor, der die massenhafte Vermehrung dieser DNA ermöglicht
1.Klonierung 70er Jahre Choen Boyerund Chang
Früher notwendig um ausreichende DNA zu bekommen
Vorteile: als Klon DNA so Stabil und unproblematisch im Umgang >kann sie nicht verlieren Man kann DNA-Fragmenten zusätzliche eigenschaften verleihen
87
Klonierung von DNA -Fragmenten ablauf was ist notwendig?
```
Rückseite
Vektor
Restrikonsverdau:
LIgation
Transformation in Bakterien
Selektionsmarker
PCR
Gelelektrophorese
```
88
Mit welchem Vektor-(Klonierung). Welche gibt es?
```
Rückseite
Plasmidvektoren (3kb)
Phagenvektoren
Cosmide
BACs
YACs
```
89
Was sind Plasmide. Eigenschaften
Grundlagen:
Plasmide sind DNA-Moleküle, welche natürlich in Bakterien vorkommen. Sie können sich unabhängig vom bakteriellen Genom in Bakterien vermehren
GrundlegendenEigenschaften sind
• zirkuläre ,doppelsträngige DNA -Moleküle
• beinhalten nur wenige Gene
• kleineGröße ( nur wenige tausend Basenpaare )
• ein Replikationsstar
90
Die Minimalausstattung eines Plasmids besteht aus?
* einem Replikationsstart ( origin of replication ,,ori )
* einem Selektionsgen (meist einAntibiotikaresistenzgen )
* einer Klonierungsstelle mit mehreren einmaligen Schnittstellen für Restriktionsenzyme (multiple cloning site )
91
Restriktionsenzyme
Bakterien schützen sich vor Fremd - DNA durch Restriktionsenzyme (Restriktionsendonucleasen )
Bakerielle DNA ist durch Methylierung geschützt
Restriktionsenzyme erkennen bestimmte kurze DNA - Sequenzen
92
Es gibt 3 Klassen von Restriktionsenzymen. Welche ? welche werden für die Genklonierung verwendet?
Typ I
Erkennen spezifische Sequenzen, schneiden aber unspezifisch, benötigen ATP
Typ II
Schneiden spezifisch innerhalb der Erkennungssequenz, benötigen kein ATP
Typ III
Erkennen spezifische Sequenzen, schneiden 20 -25 Nukleotide entfernt davon, benötigen ATP
Nur Enzyme der Klasse II werden für Genklonierungen verwendet
93
Verwendung der Restriktionsenzyme in der Molekularbiologie:
•zur Vorbereitung einer Ligation
(Herstellung von rekombinanten DNA - Molekülen, Genbibliotheken )
• Überprüfung von DNA Identität
• Mapping von DNA
94
Palindrome
Erkennungsequenz für Restriktionsenzyme
vier bis sech oder acht Basenpaaren
Symetrisch aufgebaut in beieden strängen gleich
--> Sticky ends und blunt ends
95
Ligation
Behandelt man den Vektor mit den gleichen Restriktionsenzymen wie das DNA - Fragment, so besitzen die einzelnen Moleküle beider DNAs die gleichen offenen Restriktions - schnittstellen an ihren Enden.
So kann sich ein Vektormoleküls mit einem Molekül genomischer DNA durch Basenpaarung verbinden.
Diese rekombinierten Moleküle werden mit dem Enzym DNA- Ligase kovalent geschlossen.
Das Standardenzym für Ligation ist die T4 DNA - Ligase Sie ist extrem schnell und genügsam bezüglich der Pufferbedingungen.
96
Vorderseite
| Transformation in Bakterien. In welche Bakterien?
Es existieren viele verschiedene Bakterienstämme mit gut
charakterisierten Eigenschaften.
Da wir die Blau -weiß - Selektion nutzen möchten, brauchen wir einen Stamm, der das LacZ - Gen im Vektor komplementie
97
Herstellung kompetenter Zellen und Transformation. KOMPETENZ
Rückseite
Kompetenz : Fähigkeit fremde DNA aufzunehmen ( ein physiologischer Zustand)
Die klassische Methode, Bakterien transformationskompetent zu machen, funktioniert mit Inkubation in Calciumchlorid bei 0°C.
Die kompetenten Bakterien werden dann mittels Hitzeschock transformiert.
Eine weitere Möglichkeit sind Elektrokompetente Bakterien, die mittels Elektroporation transformiert werden
98
Selektionsmarker
z.B. Antibiotikaresistenz
| Blau-weiß selektion ( ß galactosidase als markergen)
99
Antibiotika als selektionsmarker: Man unterscheidet folgende Wirkmechanismen.
bakteriostatisch:
Bakterien werden an der Vermehrung gehindert
bakteriozid:
Bakterien werden zwar getötet, sind aber weiterhin physisch vorhanden
bakteriolytisch:
Bakterien werden getötet, ihre Zellwand wird aufgelöst
100
Das lac-Operon
Rückseite
Enzyme für den Lactoseabbau werden gemeinsam und in gleicher Menge produziert,weil die Gene gemeinsam abgelesen werden.
Der Operator , als regulierender Genabschnitt vor den Genen kann mit dem Repressor in Wechselwirkung treten.
Vor dem Operator ist der Promotor , der DNA - Abschnitt, der die DNA - Polymerasebindet.
Die DNA -Polymerasekann nur Strukturgene ablesen, wenn der Operator nicht durch
einen Repressor blockiert ist.
Wenn sich ein Lactose Molekül an den Repressor bindet, verliert er dadurch seine
spezifische Bindungsfähigkeit und die Transkription der Strukturgene
kann erfolgen.
Die Funktionseinheit von Operator, Promotor und Strukturgen wird als operon
bezeichnet.
101
lac operon Aktivatoren
Für die Analyse kann anstelle von Lactose als Induktor ein Analogon IPTG eingesetzt werden
da E.coli IPTG nicht spalten kann
102
PCR: Kompenenten
Ausgangs - DNA ( Template )
Oligonukleotide ( Primer ) → 2 spezifische (18 - 25 bp )
hitzestabile DNA - Polymerase (z.B.Taq - DNA - Polymerase )
Desoxynucleosidtriphoshate ( dATP,dCTP ,dGTP , dTTP = dNTP s )
DNA - Polymerase benötigt einen speziellen Reaktionspuffer
PCR - Apparat ( Thermocycler ), der nach einem programmierten
Muster die erforderlichen Temperaturwechsel durchführen kann
103
Gelelektrophorese
Elektrophorese = Wanderung geladener Teilchen im elektrichen Feld
Agar Gel aus Agarose und Agaropektin
Agarose:Lineraes Polymer der Agarbiose, ca. jede 10 Rest sulfatier(ester)
AgaropektinHöhererVeresterunggrad auch verzweigungen
104
Womit wird die DNA bei der Gelelektrophorese sichtbar gemacht?
Färbung der DNA mittels Ethidiumbromid
Dieser Farbstoff kann sich zwischen die nt Basenstapel der DNA schieben, man nennt das interkalieren.
Der Farbstoff leuchtet orange, wenn er mit UV- Licht angeregt wird.
Das Besondere ist jedoch, dass er wesentlich intensiver leuchtet (50 - 100) mal, wenn er in DNA interkaliert ist, als wenn er frei vorliegt
-->Krebsterregent
105
Analyse von Plasmid‐DNA ‐ 1
| Welche Möglichkeiten gibt es?
a) PCR – Amplifikation eines DNA‐Abschnittes
‐ Oligonukleotide/Primer werden benötigt
‐ wenn nur Vektor‐Sequenz bekannt ist, kann man nur die Größe des inserts bestimmen
‐ kloniert man eine bekannte DNA‐Sequenz, kann man mittels spezifischer Primer das Vorhandensein/Position dieser spezifischen DNA im Vektor überprüfen
b) Restriktionsverdau
‐ wenn nur Vektor‐Sequenz bekannt ist, kann man nur die Größe des inserts bestimmen bzw. Aussagen über vorhandene Schnittstellen treffen
‐ kloniert man eine bekannte DNA‐Sequenz, kann man mittels spezifischer Endonukleasen das Vorhandensein/Position dieser DNA im Vektor anhand der erwarteten Fragmentgrößen überprüfen
106
1.) Genetischer Infomationfluss
DNA--------------> RNA---------------> Protein
| Transkription Translation
107
2)Struktur eines typischen eukaryotischen Pflanzengens.
Rückseite
Upstream regulatory
Promoter( CAAT-box TATA-box)
Transkriptet region
108
2.1.)Die häufigsten konservierten regulatorische Sequenzmotive in A.tahliana
Die häufigsten konservierten regulatorische Sequenzmotive in der
proximalen 5'-upstream Region von Genen sind bei Arabidopsis thaliana die
GC-Box, die CAAT-Box und die TATA-Box
109
2.2.)Transkriptionsinitiation durch RNA Polymerase II
Eukaryontische Promotoren werden zuerst von "allgemeinen Transkriptionsfaktoren (TFs)" TBP/TFIID, TFIIA, -B, -F, -E und -H erkannt
Diese bilden den Präinitiationskomplex
Dabei bindet das TATA-Box Binding Protein (TBP) an die TATA-Box
Die RNA-Polymerase II bindet nicht direkt an den Promoter (wie bei Bakterien), sondern an die Proteine des Präinitiationskomplexes
Das Startsignal für den Beginn der Transkription ist die Phosphorylierung der CterminalenDomäne (CTD) der RNAPolymerase II durch TFIIH.
110
2.3.)Für die Transkriptionsinitiation in vivo werden zusätzliche Proteine benötigt:
Transkriptionsaktivatoren (spezielle Transkriptionsfaktoren),
der Mediator-Komplex, der Aktivatoren (oder Repressoren) mit dem basalen Transkriptionskomplex verbindet und diesen so reguliert.
Nucleosomen-modifizierende Enzyme (Chromatin remodeler; HAT, Histonacetylasen)
111
Die Regulation der Transkription bei Eukaryonten involviert viele Proteine:
DNA-biegende Proteine bringen weit entfernte Transkriptionsaktivator-
Bindestellen (Enhancer) zur RNA Pol II
Transkriptionsaktivatoren steuern dieentwicklungsspezifische,gewebespezifische und
durch externe Stimuli induzierte Transkription
112
2.3.3)Regulatorische Schritte bei der Realisierung der genetischen Information
```
Rückseite
DNA---------------> prä-mRNA-------------------------> mRNA------------------> Protein
Transkription Splicing, Capping,Tailing Translation
• Zugänglichkeit der DNA
• Initiation der Transkription
• Regulation der mRNA-Reifung
• Transport in das Cytoplasma
• Stabilität der mRNA
• Posttranslationale Modifikationen
• Proteinstabilität
```
113
2.3.5.)Was passiert mit den Nucleosomen bei der Transkription?
Nuclesomen löstsich auf und ensteht an einer neuen stelle
114
3.)Einige Kriterien für die Identifizierung eines Gens aus der Sequenz in silico
In einem der sechs Leseraster muss ein Startcodon vorhanden sein.
Bis zum ersten Stoppcodon muss ein ausreichend langes Offenes Leseraster (Open reading frame, ORF) vorhanden sein (d.h. eine ununterbrochene Abfolge von Triplettcodes), um ein - zumindest kleines - Protein zu kodieren. Mögliche Introns sind zu berücksichtigen.
In 5´-Richtung vom ATG sollten typische Promotersequenzen vorhanden sein, u.a. bei den meisten Genen eine TATA-Box.
In 3´-Richtung sollten Sequenzen vorhanden sein, die für die Termination der Transkription und die Polyadenylierung wichtig sind.
Im vorhergesagten Transkipt bzw. Gen können (müssen aber nicht) die Konsensussequenzen von Intron-Exon-Grenzen vorhanden sein.
Hilfreich können Vergleiche mit bekannten paralogen oder orthologen Genen aus dem gleichen bzw. anderen Organismen sein.
Der experimentelle Beleg, dass es sich bei einer fraglichen Sequenz um ein exprimiertes Gen handelt, erfolgt durch die Identifizierung der dazu passenden mRNA.
115
cDNA , EST
cDNA >mit Hilfe einer Reversen Transkriptase. Rnase H und DNA-Polymerase aus mRNA hergestellte copy-DNA
EST >expressed sequence tag, Teilsequenz einer cDNA
116
RNA-Seq
Altarnative zu Microarrays
cDNA aus mRna wird sequenziert
vieles kan damit sequenziert werden
117
Prinzip der RNA-Seq
RNA wird zu cDNA konvertiert und anschließend fragmentiert.
Die Sequenzierung der Fragmente
„reads“, werden generiert
mit dem Referenzgenom (oder Transkriptom) verglichen
Anzahl der reads pro Gen gibt Auskunft über die Expressionsstärke
118
Wie wird die Expression einzelner oder vieler Gene bestimmt?
```
Analyse einzelner oder weniger Gene
- Northern blot-Analyse (RNA Blotanalyse)
- Real time quantitative RT-PCR
- Promoter-Reportergenfusionen
- In situ-Hybridisierung
Genomweite Transkriptanalysen (Trancriptomics)
- Microarrayanalyse
- RNA-Seq
- In silico Analyse
```
119
7.) Northern blot-Analyse (RNA gel blot analysis)
Schematische Darstellung einer Northern blot-Analyse.
RNA wird isoliert, durch Agarosegelelektrophorese getrennt, auf eine Nylonmembran übertragen und mit einer markierten komplementären DNA-Probe hybridisiert. Die Markierung der DNA kann radioaktiv ( P) oder nichtradioaktiv(Digoxygenin) erfolgen.
Typisches Autoradiogramm als Ergebnis einer Northern blot-Analyse.
Die Quantifizierung der Signalstärke kann mit Hilfe eines Phosphoimagers erfolgen. rRNA wird in der Abbildung als Ladekontrolle gezeigt. Northern blot-Analysen galten lange Zeit als Standard.
Nachteile: Nachweis nur einzelner oder weniger Gene, große Mengen RNA erforderlich, Ergebnis meist nur semiquantitativ.
>Heute meist durch ´Real Time quantitative Reverse Transcription PCR´ (qPCR, real
time PCR) ersetzt.
120
8.)Reportergene in der Pflanzengenetik
Meist wird eines der drei folgenden Reportergene benutzt:
ß-Glucuronidase (uidA, GUS)
einfach zu benutzen, preiswert, histochemischer und quantitativer fluorimetrischer
Test möglich, meist genutztes Reportergen
Green fluorescent protein (GFP) und Varianten mit anderen Emissionswellenlängen
häufig in der Zellbiologie zur Bestimmung der subzellulären Lokalisation genutzt;
für Entwicklungsbiologen ein wichtiges Markergen für Zellen und Gewebe
Luciferasegen (LUC)
Vorteil: kann nicht-invasiv ohne Zerstörung von Gewebe genutzt werden; aber:
geringe Sensitivität, geringe räumlich Auflösung der Expressionsmuster; meist für
zeitliche Auflösung der Expression und genetische Screens genutzt
121
8.1.)Fluoreszierende Proteine als Reporter
Das GFP Gen wurde ursprünglich aus der Quallenart Aequora victoria isoliert.
Das 24 kDa große Protein wird mit Blaulicht (395 nm) angeregt, das Maximum der Emission liegt bei 509 nm.
Mittlerweile existieren viele Farbvarianten.
GFP ist besonders geeignet für die Analyse der Genexpression in der Wurzel und der subzellulären Lokalisation von GFP Fusionsproteinen.
122
8.2)Das Luciferasegen als Reporter
In der Natur kommt die Luciferin-Luciferasereaktion zur Erzeugung von Biolumineszenz in den Peroxisomen eines spezialisierten Lichtorgans von Leuchtkäfern (Photinus pyralis)vor.
Die Luciferasereaktion benötigt das Substrat Luciferin und die Kofaktoren ATP, O2 und Mg2+,
sie führt zur Emission von gelb-grünem Licht (560 nm).
Gekühlte CCD (chargecoupled devise)-Kameras werden zur Detektion der Aktivität in planta benötigt
123
9)mRNA in situ Hybridisierung
Rückseite
Bei der in situ-Hybridisierung werden mRNAs genspezifisch in Gewebeschnitten mittels markierten DNA-Sonden detektiert.
Die Bilder zeigen die in situ-Detektion eines Gens in einem Embryo mit Hilfe einer Digoxigenin (DIG)-markierten Probe.
Digoxigenin selbst wird wiederum mit einem Antikörper detektiert, der an ein Enzym gekoppelt ist (Alkaline Phosphatase oder Peroxidase),
das aus chromogenen Substraten ein blaues oder braunes Präzipitat bildet.
Das Präzipitat markiert des Ort der Genexpression.
Die mRNA des Gens CLV3 wurde mit einer radioaktiv markierten DNA-Sonde hybridisiert und davon ein Autoradiogramm angefertigt (Falschfarbendarstellung).
In situ Hybridisierung liefert sehr spezifische Information über die
Genexpression, ist allerdings zeit- und arbeitsaufwendig.
124
9.1.In silico Analyse der Genexpression
Für die Analyse der Genexpression in silico sind verschiedene Webtools verfügbar.
Z.B. Genevestigator Mit Hilfe von Genevestigator können rasch verfügbare Expressionsdaten für jedes Gen zusammengestellt werden. Welche Gene werden in welchem
Gewebe, in welchem Entwicklungsstadium oder in Antwort auf bestimmte
Stressreize (z.B. Kälte, Wärme, Licht, Nährstoffmangel usw.) exprimiert?
125
2.)Funktionelle Domänen von Transkriptionsfaktors
Ein Transkriptionsfaktor hat mehrere distinkte und funktionell wichtige Domänen:
- DNA-Bindedomäne (DBD)
- Aktivierungsdomäne (AD)
- Kernlokalisationssequenz (NLS)
- Weitere Domänen zur Interaktion mit Effektoren (meist andere Proteine, selten
kleine Moleküle)
126
Transkriptions-Familien
```
Transkriptionsfaktoren werden anhand der strukturellen Ähnlichkeit ihrer DBD in Familien und Superfamilien eingeteilt.
Große Transkriptionsfaktor-Familien sind :
AP2/ERF,
bHLH,
Zn-Finger,
MYB,
WRKY,
NAC
```
127
3.)Wichtige Domänen von Transkriptionsfaktoren die in Kontakt mit der DNA-dopelhelix treten:
Helix-turn-Helix
Luecine Zipper
Zinc finger
Die DNA-Bindedomänen vermitteln die Spezifität der DNA-Protein-Interaktion.
128
1.)Das Helix-Turn-Helix-Motiv
Bildet 3 helixe
Helix 3 tritt in der Großen Furche in Kontakt mit der DNA,
Helix 1 und Helix 2 liegen außerhalb der DNA.
I-I
129
3.2.)Der Leucin-Zipper
ist eine Domäne, die Protein-Protein-Interaktionen ermöglicht
Die basischen Regionen des sogenannten bZIP-Motifs interagieren mit der DNA.
Die basischen Regionen von zwei Proteinen werden durch die Interaktion von hydrophoben Leucin-Resten („Leucin-Zipper“) zusammengehalten und korrekt orientiert.
130
3.3.)Das Zn-Finger-Motiv
Meist kommen in einem Protein mehrere Zn- Finger gemeinsam vor, .
Die α-Helix auf der C-terminalen Seite bindet in der großen Furche an die DNA.
131
4.)Die Aktivierungsdomäne von Transkriptionsfaktoren
Die Aktivierungsdomänen (AD) von Transkriptionsfaktoren sind weniger gut
charakterisiert als die DBD.
Sie sind meist reich an sauren, d.h. negativ geladenen
Aminosäuren (Asp, Gln) oder (seltener) reich an Glutamin oder Prolin.
Die AD weisen eine geringe Spezifität auf, die AD verschiedener Transkriptionsfaktoren sind häufig austauschbar.
AD beeinflussen die Anlagerung des Transkriptionskomplexes an den Promotor
und verstärken somit die Transkriptionsaktivität eines Gens. Der genaue
Mechanismus, wie sie zur Aktivierung der Transkription beitragen, ist allerdings
unklar.
132
5.)Wie kann Aktivität von Transkriptionsfaktoren reguliert werden ?
Regulation der Neusynthese des Transkriptionsfaktors,
z.B. durch positive oder negative Regulation an dessen eigenem Promoter.
Aktivierung oder Deaktivierung des Transkriptionsfaktors durch
Phosphorylierung bzw. Dephosphorylierung.
Aktivierung (bzw. Freisetzung) durch Bindung eines Liganden (Effektors).
Aktivierung (bzw. Freisetzung) durch den Abbau eines Inhibitors.
133
5.1..)Cytokinin-Signalübertragung
Die Transkriptionsfaktoren der Cytokininantwort sind sogenannte Typ B-Responseregulatoren, die zur Myb-Klasse der Transkriptionsfaktoren gehören.
Sie werden durch Phosphorylierung aktiviert.
Das Signal für die Phosphorylierung gelangt über einen sogenannten „His-to-Asp-Phosphorelay“von membranständigen Cytokininrezeptoren durch Phosphotransmitterproteine in den Zellkern.
134
5.2.) Auxin-Signalübertragung
Normalerweise werden Auxin-Responsefaktoren (ARF) durch kleine Proteine (Aux/IAA)inhibiert,
es findet dann keine Transkription von Auxin-Antwortgenen statt.
Auxin vermittelt die Bindung von Aux/IAA an einen Proteinkomplex (SCF-TIR; TIR ist ein Auxinrezeptor),
der Aux/IAA mit Ubiquitin (Ub) für den Abbau markiert.
Dadurch werden ARFs freigesetzt und können nun Auxin-Antwortgene aktivieren.
135
6)Wie wird der Promoter eines Gens funktionell analysiert?
Die Analyse von Punktmutationen im Promoter und den upstream-regulatorischen Regionen (= in 5´-Richtung oder stromaufwärts gelegen) zeigt, daß nur Mutationen in den konservierten Boxen zu einer starken Reduktion der Transkriptionsaktivität führen
Funktionell wichtige Bereiche im Promoter können durch Mutation identifiziert werden.
Promoter-Deletionsanalyse
136
1.) Promoter-Deletionsanalyse
Die Deletionsanalyse ist ein Standardverfahren, um funktionell wichtige Promoterbereiche zu identifizieren.
Dabei werden sukzessive größere Abschnitte aus dem Promoter entfernt
und die Promoteraktivität mit Hilfe eines Reportergens gemessen.
Verlust der Antwort auf einen bestimmten Stimulus bedeutet das funktionell wichtige Sequenzen deletiert wurden.
137
7.)Der Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)
Prinzip der EMSA‐Methode
Beim Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) erzeugt die Bindung von Kernproteinen an die DNA ein verändertes Laufverhalten (´Shift´) in einem Polyacrylamidgel.
Die DNA wird radioaktiv markiert und durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
Im EMSA werden typischerweise DNA-Abschnitte getestet, die zuvor durch Deletionsanalyse identifiziert wurden.
138
8.)Yeast One‐Hybrid‐Methode
Yeast One-Hybrid ist eine genetische Methode, um Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, die an eine bestimmte DNA-Sequenz binden.
Die DNA-Sequenz (hier Response-Element T) wird in ein Plasmid vor einen Minimalpromoter und das HIS3 Gen inseriert sowie in einen Hefestamm transferiert, der nur ein defektes HIS3 Gen besitzt.
Dieser Stamm wird mit einer Genbibliothek transformiert,die Fusionen von DBD mit der AD des GAL4 Faktors enthält, und auf Medium ohne Histidin ausplattiert.
Vermittelt die DBD des Fusionproteins GAL4-AD-DBD eine Bindung an die Zielsequenz (T), so kann die Hefezelle ohne Histidin wachsen.
139
9.EMS
EMS wird bei Arabidopsis samen als Mutagen benutzt welche wiederrum in der Vorwärtsgenetik benutzt werden
Es ist ein Alkylierungsmittel ( hauptsächlich auf G) zur Änderung der Basenpaarung und verursacht vorallem Punktmutationen (transitions) .
140
3.)Besonderheiten von Pflanzen
• sessile Lebensform /müssen sich veränderten Umweltbedingungen anpassen
• feste Zellwände
• keine Zellmigration
• Plasmodesmata / Symplast
• kein geschlossener Flüssigkeitskreislauf
• Pflanzen besitzen keine Keimbahn
• große Plastizität und Totipotenz
• ständige Bildung von neuen Organen in den Meristemen – indeterminiert
(unbegrenzt) gegen determiniert (begrenzt in Raum und Zeit)
141
4.)Zentrale Fragen in der Entwicklungsbiologie
1) Wie kann aus einer Zygote ein Embryo werden?
2) Embryo zum Keimling (Pflanzen)?
3) Woher weiss eine Zelle, was sie machen soll?
4) Woher weiss eine Zelle, was sie ist (Zellidentität)?
5) Was macht der Nachbar?
6) Wie differenzieren sich Zellen?
7) Wie entstehen neue Strukturen?
8) Wie bilden sich spezialisierte Gewebe in einem bestimmten Muster
142
4.1) Ultimatives Ziel der Entwicklungsbiologie
Ultimatives Ziel:
Wie wird Wachstum, Zelldifferenzirung und Musterbildung auf zellulärer,
biochemischer und molekularer Ebene reguliert
+ genetische Basis der Entwicklung (weil Entwicklung ist die Folge von genetischen
Programmen)
143
4.2)How the different parts of the embryo were formed?
1. Preformation
| 2. Epigenesis (“upon formation”)
144
5.)Die Möglichkeiten einer Zelle
Rückseite
wachsen– sich teilen– differenzieren– sterben
Definitionen
Wachstum: Zunahme an Volumen
Zellteilung: Vermehrung (symmetrisch vs. asymmetrisch)
Differenzierung: Entwicklungsprozess, bei dem aus ursprünglich gleichartigen, unspezialisierten (zumeist neu gebildeten) Zellen strukturell und funktionell unterschiedliche Zellen entstehen.
‐Im Gegensatz zu tierischen Zellen können ausdifferenzierte pflanzliche Zellen später wieder entdifferenzieren und dann mehrzellige Organismen ganz neu bilden.
Morphogenese: Entwicklung/Bildung der endgültigen Form
Musterbildung: die räumliche Organisierung sich differenzierender Einheiten zu einem
übergeordneten Ganzen.
145
Embryogenese
Der Prozess, mit dem die Pflanzenentwicklung beginnt.
Während der Embryonalentwicklung entsteht aus der einzelligen Zygote durch Zellteilung und Differenzierung ein vielzelliger Embryo
Bildung einer komplexen Struktur − der Keimling
bildet nicht direkt die Gewebe und Organe des adulten Organismus
Die Körperorganisation des Keimlings:
1) apikal‐basale Achse
2) radiales Muster
…und die Primärmeristeme
146
6.2)Zwei verschiedene Faktoren tragen zur Pflanzenentwicklung bei
1) intrinsische Faktoren – genetisches Programm
| 2) extrinsische Faktoren– Umwelteinflüsse
147
8.) Pflanzliche Stammzellen
das Spross‐ und Wurzelmeristem
Was sind Meristeme?
-Population von kleinen, isodiametrischen Zellen (gleicher Durchmesser) mit embryonalen Charakteristika
-sich selbst erneuernd
Stammzellen
‐ behalten embryonalen Charakter lebenslang
‐ differenzieren sich nicht solange das Meristem vegetativ bleibt
‐ teilen sich langsam
Interaktion zwischen den CLAVATA und WUSCHEL Regulationswegen
Erhaltung des Triebmeristem ist abhängig von der Koordinierung der beiden antagonistischen Prozesse, Organ intitation und Selbsterneuerung der Stammzellpopulation
148
8.2) Schicksal einer Zelle hängt womöglich ab von
* dem klonalen Ursprung
| * der Position der Zelle
149
9)Auxin- Verteilung
Auxin(als Morphogen) Verteilung ist in der frühen Entwicklung des Embryos wichtig
DR5: GFP marker gene
Veränderungen der lokalen Auxin Maxima während der Embryogenese
Lokalisierung der PIN -Proteine an den Grenzen der embryonalen Zellen
• GNOM eine Guaninnukleotidaustauschfaktor das für den Transport von PIN1 aus einem endosomalen Kompartiment auf die Membran an einer Seite einer Zelle zuständig ist.
150
9.1)Die Rolle von Auxin in der Embryogenese
* eine Möglichkeit der Auxin induzierten Genexpression ist die Aktivierung der Monopteros (MP) Protein
* Auxin löst den Repressor von MP , welcher dann die Transkription eines Wurzel Entwicklung Gen aktiviert
151
Vorderseite
| 1)Theorien von Darwin
1. Evolution der Arten
- Arten verändern sich mit der Zeit
2. Gemeinsamer Ursprung der Arten:
- Alle Arten hatten einen gemeinsamen Vorfahren
3. Kontinuierliche Abweichung der Arten:
- Alle Arten werden immer unterschiedlicher
4. Gradualismus:
- Arten verändern sich in kleinen Schritten 5. Natürliche Selektion:
- Natürliche Selektion ist der wichtigste Faktor der Evolution
6. Sexuelle Selektion:
- Entwicklung von sexuellen Dimorphismus
152
1.1.)Notwendige Prinzipien für Darwins Theorien
1.Das Prinzip der Variabilität: Innerhalb der Individuen einer jeden Population gibt es genetisch determinierte Variationen in der Morphologie, der Physiologie und dem Verhalten.
2.Das Prinzip der Selektion: In einer veränderten Umwelt ist die Überlebensrate und der reproduktive Erfolg einiger Individuen höher als der von Anderen.
3.Das Prinzip der Vererbbarkeit: Nachwuchs ist seinen Eltern ähnlicher als nicht-verwandten Mitgliedern der gleichen Population.
Notwendige Prinzipien für Darwins Theorien
153
Gründereffekt
Rückseite
* Verursacht durch die “Besiedlung” eines neuen Habitats
* Führt zur schnellen Vermehrung ohne Selektion
* Kann zur Fixierung von leicht negativen Eigenschaften führen
154
Flaschenhalseffekt
* Verursacht durch katastrophale Ereignisse
* Führt zur schnellen Vermehrung ohne Selektion
* Kann zur Fixierung von leicht negativen Eigenschaften führen
155
2.1.) Ebenen der Selektion
Genselektion (Selektion von Allelen)
•z.B. „Selfish Gene“ from Richard Dawkins
Individuen Selektion (Darwins „Survival of the fittest“)
• z.B. Selektiver Vorteil führt zu einer höheren Anzahl an Nachkommen
Verwandtenselektion (Verstärkt Eigenschaften die wichtige für eine Gruppen von Verwandten sind)
•z.B. unterstütze Deine Verwandten weil sie Dir genetisch am ähnlichsten sind
Artenselektion (Selektion einer Art im Wettbewerb mit anderen Arten)
•z.B. Wichtiges Konzept der Evolutionsbiologie
156
2.2)Arten der Selektion
Natürliche Selektion (Umweltfaktoren treiben die Selektion)
z.B. ein Fell schützt gegen die Kälte, Haare auf Pflanzen schützen gegen UV
Sexuelle Selektion (Partnerwahl und Wettbewerb treiben die Selektion)
z.B. Hirschgeweih, Pfauenfedern
Elterliche Selektion (Eltern forcieren Selektion)
z.B. einige Eltern füttern nur den stärksten Nachwuchs
Künstliche Selektion (Menschen treiben die Selektion)
z.B. Domestizierung von Tieren und Pflanzen
157
2.4.)Richtung der Selektion:
```
Stabilisierende Selektion (Eliminiert die Extreme einer Population)
Disruptive Selektion (Eliminiert den Durchschnitt einer Population)
Gerichtete Selektion (Eliminiert nur eine Art der Extreme einer Population)
```
158
3.) Mechanismen zur Erzeugung neuer Sequenzen
»Genome Duplikation
»Veränderungen der Chromosomen
»Veränderungen in Teilen oder in ganzen Genen
159
3.1.) Ursprung neuer genetischer Sequenzen
```
Gen duplikation
Retrotranpositions
Lateral gen transfer
Gen Spaltung oder Fusion
alternative splicing
non coding RNA
Pseuogene als RNA regulatoren
```
160
4.) Ursprung evolutionärer Neuerungen
Mutationen von bereits existierenden Genen können die Aminosäuresequenz so verändern, dass eine neue Funktion entsteht
Mutationen in regulatorischen Sequenzen können die Genexpression so verändern das neuen Formen und Funktionen von Geweben und Organen entstehen (z.B. homöotische Mutationen).
Neue Funktionen können aus neuen DNA Sequenzen entstehen, die durch z.B. Duplikation, Transposition oder horizontalem Gentransfer verursacht wurden. Diese Veränderungen können die kodierende und/oder cis-regulatorische DNA Sequenzen betreffen.
