Genetyka - laby

Question 1

Metody izolacji DNA

Answer 1

• izolacja z zastosowaniem fenolu i chloroformu w celu odbiałczenia preparatu
• izolacja przebiegająca przez wysolenie białek z lizatów komórek
• izolacja przez związanie z nośnikiem, odmycie zanieczyszczeń i uwolnienie DNA

Question 2

Etapy izolacji DNA

Answer 2

1. Wstępne przygotowanie materiału do izolacji DNA
2. Dezintegracja i liza komórek oraz uwolnienie DNA
3. Oddzielenie kwasu nukleinowego od innych komponentów komórkowych
4. Zagęszczenie preparatu DNA i usunięcie zanieczyszczeń

Question 3

Wstępne przygotowanie materiału do izolacji DNA

Answer 3

• oczyszczenie
• homogenizacja
• rozpuszczenie w odpowiednim buforze

Question 4

Dezintegracja i liza komórek oraz uwolnienie DNA

Answer 4

1. Rozbicie ściany i błony komórkowej (homogenizacja, sonikacja, rozcieranie, liza detergentami, liza enzymatyczna)
2. Uwolnienie DNA i innych komponentów komórkowych
   - NaCl (DNA lepiej się rozpuszcza w NaCl)
   - Tris-HCl (bufor, utrzymanie stałego pH)
   - EDTA (wiąże jony Mg2+ i Mn2+ - kofaktory enzymów)
3. Inaktywacja enzymów nukleolitycznych
   - enzymy proteolityczne (proteinaza K)
   - izotiocyjan guanidyny (denaturuje białka bez naruszenia DNA)

Question 5

Oddzielenie DNA

Answer 5

1. Dysocjacja kompleksów DNA-białko
   - SDS (łączy się z białkami nadając im silnie anionowy charakter)
2. Oddzielenie DNA od innych komponentów komórkowych
   - fenol (oddziela DNA od związanych z nim białek)
   - chloroform (powierzchniowa denaturacja białek)
   - alkohol izoamylowy (redukuje pienienie)

Question 6

Wygląd probówki po oddzieleniu DNA

Answer 6

Tworzą się trzy fazy:
- górna (wodna) z DNA
- interfaza z białkami
- dolna (organiczna) z lipidami

Question 7

Zagęszczenie preparatu DNA i usunięcie zanieczyszczeń

Answer 7

1. Precypitacja z alkoholem
   - etanol/izopropanol zmniejsza polarność środowiska i DNA się wytrąca
2. Wyschnięcie i rozpuszczenie
   - DNA zawieszany w małej objętości roztworu

Question 8

Porównanie DNA i RNA: miejsce występowania

Answer 8

• DNA: jądro komórkowe (również mitochondria i chloroplasty)
• RNA: cytoplazma, rybosomy, jądro komórkowe

Question 9

Porównanie DNA i RNA: struktura

Answer 9

• DNA: zawsze podwójna helisa
• RNA: najczęściej pojedyncza nić różnie ułożona

Question 10

Porównanie DNA i RNA: Budowa nukleotydu

Answer 10

DNA:
- reszta kwasu fosforowego
- deoksyryboza
- 1 z 4 zasad azotowych (adenina, tymina, cytozyna, guanina)
- funkcja: nośnik informacji genetycznej

RNA:
- reszta kwasu fosforowego
- ryboza
- 1 z 4 zasad azotowych (adenina, uracyl, cytozyna, guanina)
- umożliwia realizacje informacji genetycznej

Question 11

Izolacja RNA z użyciem TRIZOL-u

Answer 11

1. Liza komórek z TRIzolu (i inaktywacja endogennych RNaz)
2. Ekstrakcja zanieczyszczeń białkowych i rozdział DNA i RNA za pomocą chloroformu
3. Wirowanie (tworzą się trzy warstwy)
4. Wytrącenie i koncentracja RNA za pomocą izopropanolu
5. Osuszenie i rozpuszczenie osadu RNA

Question 12

Czym jest TRIzol?

Answer 12

Mieszanina fenolu, izotiocyjanianu guanidyny i innych związków, które prowadzą do lizy komórek i inaktywacji endogennych RNaz

Question 13

Inne metody izolacji RNA: metoda kolumienkowa

Answer 13

1. Liza komórek w buforze zawierającym sole chaotropowe, dodatkowo dodawana jest proteaza K
2. Mieszanina nanoszona jest na kolumnę ze specjalnym złożem krzemionkowym
3. RNA osiada na złożu, zanieczyszczenia przechodzą
4. RNA jest wymywane i gotowe do wykorzystania

Question 14

Sole chaotropowe: charakterystyka

Answer 14

• chlorowodorek lub izotiocyjan guanidyny w wysokich stężeniach
• zwiększają zdolność złóż krzemionkowych do wiązania kwasów nukleinowych
• powodują rozpad błon i denaturację białek

Question 15

Sole chaotropowe: wykorzystanie

Answer 15

• izolacja plazmidowego DNA
• izolacja całkowitego DNA
• izolacja całkowitego RNA
• elucja DNA z żeli agarozowych i poliakrylamidowych
• oczyszczanie kwasów nukleinowych po reakcjach enzymatycznych np. PCR

Question 16

Inne metody izolacji RNA: połączenie metody kolumienkowej z TRIzolem

Answer 16

Izolacja wysokiej jakości RNA bezpośrednio z próbek zawierających TRIzol z pominięciem separacji faz i precypitacji

Question 17

Inne metody izolacji RNA: kulki magnetyczne

Answer 17

1. Po homogenizacji i lizie kwasy nukleinowe są wiązane na powierzchni kulek magnetycznych
2. Kulki są oddzielane od lizatu za pomocą separatora magnetycznego
3. Po kilku przemyciach usuwane są zanieczyszczenia, oczyszczone RNA eluowane jest z powierzchni kulek przy pomocy bufora

Question 18

Sposoby pomiaru stężenia DNA i RNA

Answer 18

• pomiar absorbcji światła UV/pomiar spektrofotometryczny
• metoda fluorymetryczna

Question 19

Oznaczanie czystości preparatów DNA i RNA

Answer 19

• stosunek wartości absorbcji A260 do A280
• wartość współczynnika powinna wynosić 1,8-2
• wartość 1,5 oznacza, że w badanym preparacie DNA lub RNA jest 50% białka

Question 20

Charakterystyczna cecha widma

Answer 20

Przewężenie przy 230nm

Question 21

Wzory do obliczania stężeń DNA

Answer 21

Stężenie dwuniciowego DNA:
C (µg/ml) = (A260 – A320) × 50 × rozcieńczenie
Stężenie jednoniciowego DNA:
C (µg/ml) = (A260 – A320) × 33 × rozcieńczenie
Stężenie RNA:
C (µg/ml) = (A260 – A320) × 40 × rozcieńczenie

Question 22

Jakie substancje absorbują falę o długości 230nm?

Answer 22

EDTA, polisacharydy, etanol

Question 23

Jakie substancje absorbują falę o długości 260nm?

Answer 23

DNA, RNA

Question 24

Jakie substancje absorbują falę o długości 270nm?

Answer 24

Fenol

Question 25

Jakie substancje absorbują falę o długości 280nm?

Answer 25

Białka

Question 26

Jakie substancje absorbują falę o długości 320nm?

Answer 26

Drobiny komórkowe

Question 27

Etapy reakcji PCR

Answer 27

1. Denaturacja dwuniciowego DNA (92-96 stopni przez 30-60 sekund) 2. Przyłączanie starterów (50-65 stopni przez 30-60 sekund) 3. Wydłużanie starterów (68-72 stopni przez 60-120 sekund) Cykl powtarzany ok. 35-40x

Question 28

Skład mieszaniny reakcyjnej

Answer 28

- matryca DNA lub RNA (cDNA) - dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) - dostarczają energii, jednakowe stężenie - termostabilna polimeraza DNA - MgCl2 - bufor reakcyjny - startery - zapewniają specyficzność reakcji, dostarczają wolny koniec 3' - woda

Question 29

Polimeraza HotStart

Answer 29

Polimeraza aktywowana przez wysoką temperaturę (w termocyklerze)

Question 30

Jony Mg2+

Answer 30

- kofaktor enzymów, np. polimerazy, nukleazy - wiązane są przez polimerazę, startery, matrycę jak i dNTP - stężenie zbyt niskie -> słaby produkt lub brak produktu - stężenie zbyt wysokie -> niespecyficzne produkty (wzmożone pomyłki polimerazy) - stężenie wyższe niż stężenie dNTP

Question 31

Projektowanie starterów

Answer 31

- zawartość par GC powinna stanowić 50-60% całej sekwencji -obecność na końcu 3' G lub C - startery nie mogą tworzyć struktur typu szpilki do włosów ani dimerów starterów - temperatura topnienia starterów i przyłączania starterów

Question 32

Fazy typowej reakcji PCR

Answer 32

1. Wykładnicza - produkt gwałtownie przyrasta 2. Liniowa - poszczególne składniki ulegają wyczerpaniu 3. Plateau - wydajność ma ustabilizowany poziom, nie są tworzone nowe produkty, odbywa się pomiar produktu reakcji

Question 33

Real-time PCR

Answer 33

- jednoczesne namnażanie DNA oraz monitorowanie ilości produktów powstających podczas kolejnych cykli - w skład mieszaniny wchodzi dodatkowo barwnik fluorescencyjny (specjalnie przystosowany termocykler sprzężony ze spektofluorymetrem)

Question 34

Fazy przebiegu real-time PCR

Answer 34

1. Faza bazowa (wstępna) - fluorescencja reportera poniżej progu detekcji powielania DNA 2. Faza wykładnicza (ekspotencjalna) - w każdym etapie liczba cząsteczek ulega podwojeniu 3. Faza plateau (stacjonarna) - faza eksploatacyjna, szybkość powstawania produktu jest zmniejszona

Question 35

Źródła wzbudzanej fluorescencji

Answer 35

- barwniki wiążące dwuniciowe DNA (interkalujące) -np. bromek etydyny, Sybr Green I, Eva Green, detekcja niespecyficzna - znakowanie barwnikami sondy DNA - komplementarne do badanej sekwencji, detekcja specyficzna np. TaqMan, Molecular Beacons, Scorpions)

Question 36

Porównanie PCR i real-time PCR: pomiar jakościowy/ilościowy

Answer 36

- PCR: jakościowy/ilościowy - Real-time PCR: ilościowy

Question 37

Porównanie PCR i real-time PCR: startery

Answer 37

- PCR: tak - Real-time PCR: tak

Question 38

Porównanie PCR i real-time PCR: sonda/barwnik

Answer 38

- PCR: nie - Real-time PCR: tak

Question 39

Porównanie PCR i real-time PCR: czułość metody

Answer 39

- PCR: niska - Real-time PCR: wysoka

Question 40

Porównanie PCR i real-time PCR: detekcja produktu -metoda

Answer 40

- PCR: elektroforeza - Real-time PCR: spektrofluorymetr

Question 41

Porównanie PCR i real-time PCR: detekcja produktu - faza

Answer 41

- PCR: plateau - Real-time PCR: wykładnicza

Question 42

RT-PCR

Answer 42

- użycie mRNA jako matrycy -> odwrotna transkryptaza -> cDNA - amplifikacja sekwencji zawartej w dojrzałym mRNA (egzonów)

Question 43

mRNA

Answer 43

- udział w biosyntezie białka - przenoszenie informacji genetycznej

Question 44

rRNA

Answer 44

- składnik rybosomów, na których zachodzi synteza białek

Question 45

tRNA

Answer 45

- udział w translacji - dostarczenie aminokwasów do rybosomu

Question 46

snRNA

Answer 46

- udział w splicingu

Question 47

snoRNA

Answer 47

- udział w chemicznej modyfikacji rRNA - kierowanie potranskrypcyjnymi modyfikacjami rRNA i snRNA

Question 48

miRNA

Answer 48

- regulacja ekspresji genów przez hamowanie translacji

Question 49

siRNA

Answer 49

- regulacja ekspresji genów

Question 50

Elektroforeza: definicja

Answer 50

Zjawisko elektrokinetyczne, w którym pod wpływem przyłożonego pola elektrycznego przemieszczają się makrocząsteczki obdarzone niezrównoważonym ładunkiem elektrycznym