Grundlegende Methoden der Gentechnologie

Question 1

Was ist das grundlegende Experiment der Gentechnologie?

Answer 1

Klonierung mit Plasmiden

Question 2

Welche drei Prozesse sind wichtig in der DNA-Isolation?

Answer 2

Zentrifugieren
Lyse der Zellen
Phenolextraktion zur Proteinabtrennung

Question 3

Wie funktionieren Chromatographie-Säulen?

Answer 3

Zucker und Proteine bilden nicht an den Inhalt der Säule und passieren deshalb schneller

Wasser wird als Puffer genommen um die DNA von dem Inhalt zu lösen

Question 4

Wie funktioniert die Agarosegelelektrophorese?
Was muss man beachten?
Welcher Spannungsbereich?

Answer 4

DNA in Agarplatte und dann Ethidiumbromid und Strom drauf => DNA wandert zum + Pol da sie negativ geladen ist

Man muss aufpasssen mit der Agarose-Konzentration, da es sehr dickflüssig ist und schon eine 0,2 %ige Änderung starke Folgen haben können

0,5-5 V/cm

Question 5

Bei welcher DNA kann man eine Gelelektrophorese einsetzen?

Answer 5

Bei linearer DNA

Question 6

Was ist Southern Blot?

Answer 6

DNA wird erst durch Gelelektrophorese aufgeteilt und dann über ein Alkalisches Medium gelegt. Auf die Agaroseplatte wird eine Nitrocellulse-Platte gelegt in der sich gemarkerte DNA oder RNA Einzelstränge befinden.
Nun wird die Agarose DNA von der Alkalischen Lösung denaturiert und bindet zum Teil an die Marker => DNA kann auf Autoradiogramm bestimmt werden

Question 7

Wie sind die 4 Schritte für die einfache Hybridisierung?

Answer 7

1. Doppelstränge schmelzen und dadurch entstehende Einzelstränge auf Filter fixieren
2. Markierte DNA Einzelstränge hinzu geben => beide Strangarten hybridisieren mit einander
3. Auswaschen der ungebundenen DNA
4. Autoradiography

Question 8

Was sind Oligonukleotide?

Answer 8

In Vitro synthetisierte Einzelstränge DNA die als Primer genutzt werden (zb in PCR)

Question 9

Was sind Linker (Oligonukleotide)?

Answer 9

“Blunt ends”

Kleine eingesetzte Erkennungsstellen für bestimmte Nukleasen => werden von der Nuklease zu “stickys” zerschnitten und das gesamte Fragment ist dann einbaubar in Vektoren dieser Nuklease

Question 10

Was sind Adapter (Oligonukleotide)?

Answer 10

haben ein Blunt und ein Sticky, binden an ein Fragement mit ihrer Blunt Seite um dem Fragment eine Sticky Seite zu geben!
Dimere bilden sich nicht weil 5’ Ende (sticky) dephosphoriliert wird und deswegen nicht zwei Adapter miteinander ligiert werden können

Question 11

Wie funktioniert Sangers Didesoxy-Methode?

Answer 11

Anstatt nur Desoxynucleotide einzubauen werden auch zufällig Diddesoxynukleotide eingebaut die dafür Sorgen, dass die Kettenverlängerung abbricht => mit Gelelektrophorese und Fluoreszenzdetektor analysieren