Grüne Gentechnik Flashcards

Question

Aufbau eines Ti-Plasmids

Answer 1

**T-DNA**: Gene tragen eukaryotische Promotoren und Terminatoren, um in der Pflanze aktiv sein zu können **vir-Region** (ausgeschaltet, wenn nicht in Pflanze): Gene für Übertragung der T-DNA **Opinkatabolismus**: Abbau und Verwendung der aufgenommenen Opine **ori** **Transfergen** für Konjugation zwischen Agrobakterien

Answer 2

Gensequenzen LB, LR = notwendig und hinreichend für Erkennung der T-DNA - zwischen Grenzen kann beliebige DNA eingebracht werden - Ti-Plasmide ohne Hirmonbiosynthese-Gene = entwaffneter Ti- Gene des Ti-Plasmids können auf verschiedene Vektoren verteilt werden = binäre Vektorsysteme

Answer 3

**großes Plasmid** = Helferplasmid mit vir-Genen aber ohne T-DNA verbleibt in *A.tumefaciens* -> Stamm, verbleibt dann unverändert **kleines Plasmid** (5-14kBp): mit T-DNA und Elementen zur einfachen Handhabung z.B. mit: - Resistenzgene für Selektion in Bakterien und Pflanzen - ori für Vermehrung in *E.coli* u *A.tumefaciens* -> Klonierung und Vermehrung des Plasmids in *E.coli* -> dann Transformieren von Agrobakterien mit dem Plasmid

Answer 4

Typische Situation: Regeneration ganzer Pflanzen über Kallus-Stadium - Inkubation von Blattstücken in Agrobakteriensuspension (30 min.) - auslegen der Blattstücke auf Medium (2 Tage) - umlegen der Blattstücke auf Medium mit Antibiotika I Phytohormone -> abtöten der Agrobakterien -> Selektion transformierter Pflanzenteile (Kanamycin) -> Bildung von Kalli, aus denen Sprosse entstehen - abschneiden der Sprosse und umsetzen auf neues Medium - Sprosse bewurzeln sich => Transgene Pflanze - Tabak kann vegetativ vermehrt werden

Answer 5

- Vielzahl kommerziell verwendeter transgener Pflanzen wurden so transformiert - Trafo üblicherweise über Gewebe oder Kalluskulturen - v.A. Bei dicotyledons Pflanzen (Monokotyle wie Gräser, Getreide eher mit Biolistik) - bei einigen Arten ist Keimbahntrafo möglich -> blühende Pflanzen Transformieren und transgene heterozygous Samen erhalten

Answer 6

1. DNA im Kern natürlicher Doppelstrangbruch im Genom -> Einbau im Rahmen von Reparaturarbeiten Anlagerung der T-DNA durch Mikrohomologien (4-6 Basen, die zufällig passen) Synthese eines T-DNA Doppelstrangs durch DNA-Polymerase -> linke Grenze wird immer zuerst eingebaut => Gene of interest an linke und Resistenz an Rechte Grenze

Answer 7

= DNA-Abschnitt, der für die Bildung einer RNA-codiert - mRNA (Protein) - tRNA - rRNA … Promotorelemente: *cis*-Elemente Bindestelle für Transkriptionsfaktoren: *trans*-Faktoren

Answer 8

Aus *Agrobacterium tumefaciens*: - Promotoren & Terminatoren von Opin-Synthese-Genen -> nos (nopalin-Synthase) -> ocs (Ocotopin-Synthase) -> mas (Mannopin-Synthase) Aus Blumenkohlmosaikvirus: - 35S Promotor (CaMV-35S)

Answer 9

- starker, konstitutiv aktiver Promotor, in fast allen Geweben aktiv - „enhanced“ Version mit 2-4 enhancer Kopien = verstärkt - am häufigsten verwendeter Promotor in wissenschaftlich u kommerziell verwendeten transgenen Pflanzen - z.T. auch andere virale Promotoren FMV-35S

Answer 10

**Ubiquitin-Promotor** - Ubiquitin = in allen eukaryotischen Pflanzen exprimiert - markiert andere Proteine = Ubiquitinierung -> polyubiquitinierte Proteine werden abgebaut Bsp.: Mais-Ubiquitin-Promotor-System **Aktin-Promotor** - Aktin = Protien des Cytoskelets - in allen Zellen exprimiert Bsp.: Reis-Aktin-1-Promotor-System

Answer 11

*alcR/alcA*-Sytem von *Aspergillus nidulans* = **Ethanolschalter** - erlaubt *A.nidulans* Nutzung von Ethanol als als Kohlenstoffquelle -> AlcR: Transkriptionsaktivator -> AlcA: Alkoholdehydrogenase -> AldA: Aldehyddehydrogenase *alcR* wird ständig exprimiert Zu expremierendes Gen steht unter Kontrolle eines artifiziellen Promotors aus CaMV-35S-Minimalpromotor (allein keine Expression) und AlcR-Bindestellen aus *alcA*-Promotor

Answer 12

- Ethanol Schalter - Tetracyclin-regulierte Induktion bzw. Reprimierung - Steroid-induzierbare Systeme - induzierbare pflanzliche Promotoren -> verwundungsinduziert -> pathogen-induziert -> Hitzeschock-/Kälteschockinduziert -> Lichtinduziert/-reprimiert

Answer 13

z.B.: wurzel-/frucht-/samenspezifisch

Answer 14

1. **Codongebrauch** (codon usage/ codon bias) - degeneriertet genetischer Code - verschiedene Organismen bevorzugen unterschiedliche Codons - Anpassung daran -> bessere Expression 2. Entfernung kryptischer Introns 3. Anpassung an den pflanzlichen GC Gehalt 4. Entfernung von ATTA-Sequenzen (führen zu schnellem Abbau von RNAs)

Answer 15

Antibiotikaresistenzen Herbizidresistenzen Andere Systeme z.B. - MannosephosphatIsomerase aus *E.coli*

Answer 16

häufig z.B.: gegen **Kanamycin**: Neomycin-Phosphotransferase nptII aus *E.coli* - Kanamycin bindet an 30S UE von 70S Ribosomen & inhibiert Translation - nptII: phosphoryliert Kanamycin -> inaktiv gegen **Hygromycin**: Hygromicin-Phosphotranspherase hph aus *E.coli* - Hygromycin bindet 30S- & 40S-UE pro-/eukaryotischer Ribosomen & inhibiert Translation - hph: phosphoryliert Hygromycin -> inaktiv Working auf Organellen (insbesondere Plastiden)

Answer 17

Herbizid = Unkrautvernichtungsmittel Herbizidresizenz = häufig euch die gewünschte neue Eigenschaft - gegen Glyphosat - gegen Phosphinotricin - gegen Nitril-Herbizide - gegen Chlorsulfuron-Herbizide

Answer 18

aus *E.coli* Prinzip: - transformierte Zellen/Gewebe werden auf Mediuim mit Mannose angezogen - Mannose wird in Zellen aufgenommen & durch Hexokinase phosphoryliert -> Mannose-6-Phosphat (M6P) - M6P akkumuliert & inhibiert die Glykolyse -> Wachstumsstillstand - Mannosephosphat-Isomerase setzt M6P zu Fructose-6-Phosphat um

Answer 19

Codieren für leicht nachweisbar Genprodukte Bsp.: - **ß-Glucoronidase (GUS)** aus *E.coli* -> spaltet Verbindungen mit Glucoronsäuren, was blauen Farbstoff ergibt - **Luciferasen** aus Glüchwürmchen oder Bakterien: Substrat (Luciferin) -> Produkt + Licht Nachteil dieser Systeme: Substrat muss zugegeben werden - **grün-fluoreszierendes Protein (GFP)** der Qualle *Aequorea vicotria*: Protein, das unter UV-/Blaulicht grün fluoresziert => Reportergene werden i.d.R. nicht als Markergene verwendet (zu umständlich) => praktisch zur Untersuchung von Promotoraktivitäten

Answer 20

1. unabhängige (aber gleichzeitige) Transformation von Markergene und Transgenen -> genetische Trennung (Bsp. Yieldguard) Nachteile: - Doppeltransformanden kommen selten vor - Integration trotzdem häufig gekoppelt - Kreuzungen = zeitintensiv - bei vegetativ vermehrten Pflanzen nicht möglich 2. Herausschneiden/ Excision des Markergens: Rekombinase wie Cre/lox von P1Phage schneidet DNA & fügt die wieder zusammen -> Markergene eingeschlossen zwischen loxP Stelle % Einbau des Cre-Gens + eingeschlossen um induzierbaren Promotor

Answer 21

… zum gezielten ausschalten von Genen Gängige Methode bei Mikroorganismen, Tieren Bei Pflanzen: sehr geringe Frequenz der HR -> hier quasi nicht verwendbar

Answer 22

Mikroorganismen, Tiere: homologe Rekombination Pflanzen: - Antisense-Expression - Cosuppression - RNA-Interferenz (RNAi)

Answer 23

Ein Gen / eine cDNA wird in revers-komplementärer Richtung (antisense) exprimiert: Zielgen und antisense Gen binden aneinander -> doppelsträngige RNA dsRNA entsteht => Inhibierung der Translation & Abbau dr dsRNA

Answer 24

= starke Überrepression einer zusätzlichen Genkopie führt zum ausschalten des Transgens und des endogenen Gens

Answer 25

= Expression einer doppelsträngigen RNA inhibiert die Expression des Zielgens = Sense-antisense Expression => effektivste Methode der Genausschaltung bei Pflanzen

Answer 26

Mechanismus, der hinter antisense, RNAi und Überexpression steht Funktionsweise: 1. doppelsträngige RNA Zwischenstufe 2. RNAse „Dicer“ erkennen dsRNA und zerteilen diese 3. RISC erkennt mRNA aus kleinen Fragmenten 4. RISC zerteilt mRNA -> Expression des Gens ausgeschaltet -> es wird nicht am Zielgen selbst agiert, sondern durch einbringen eines weiteren Gens, wodurch auch Zielgen ausgeschaltet wird -> direkt am Gen eingreifen: CRISPR-CAS-9 bringt Umbruch

Answer 27

Die neue Genschere aus bakteriellem „Immunsystem“: Fremd DNA (z.B. von Phage ) wird spezifisch erkannt & zerschnitten **3 Komponenten** - crRNA: spezifisch für zu erkennende DNA - tracrRNA: bindet an Cas9 & ist an Erkennung der crRNA beteiligt - Cas9: bindet beide RNAs und schneidet Ziel-DNA

Answer 28

System funktioniert auch in Eukaryonten - tracrRNA & crRNA werden als single-guide RNA (sgRNA) fusioniert - Konstrukt für Expression der Guide-RNA und Cas9 wird in Pflanzenzelle transformiert - nach dem Schneiden kommt es zu Reparatur-> dabei häufige Fehler (Insertion/Deletion) -> defektes Gen -> wird ausgeschaltet - CRISPR/Cas9 Konstrukt kann nachträglich herausgekreuzt werden => Defekt im Gen ist stabil eingebracht & wird weitervererbt

Answer 29

Die kleinen Mutationen, die hereingebracht werden sind identisch zu natürlichen Muatationen

Answer 30

= Unkrautvernichtungsmittel Giftet die auf pflanznespezifsich Prozesse wirken z.B. Photosynthese, ASBiosynthese -> häufiger Zielort = Chlorolasten (Plastide) **selektive Herbizide**: wirken gegen bestimmte Pflanzen(Gruppen) - häufig monokotyle Pflanzen (Gräser/Getreide etc.) vs. dikotyle Pflanzen **Totalgerbizide**: wirken gegen alle Pflanzen ca 10% Ernteverlust durch Unkräuter: Konkurrenz um Platz, Nährstoffe, Licht

Answer 31

1. Sensitive Nutzpflanzen werden mit einem Resistenzen versehen 2. Einsatz hochwirksamer Totalherbizide => nur transgene Nutzpflanzen überleben

Answer 32

1. Überexpression des betroffenen Enzyms - aus der gleichen Pflanze - aus anderen Pflanzen / Organismen (häufig Bakterien) 2. Expression eines resistenten Enzyms - natürliche resistente Enzyme - Mutation eines sensitiven Enzyms 3. Abbau / Inaktivierung des Herbizids durch nicht-pflanzliches Enzym - Verstärkung der natürlichen Entgiftungsreaktionen der Pflanze

Answer 33

Möglichkeiten zur Erzeugung Glyphosatresistenter Pflanzen: 1. **Überexpression** der EPSP-Synthase 2. Verwendung einer **mutierten EPSP-Synthase**, die Glyphosat nicht bindet - EPSP Synthase des *A.tumefaciens* Stammes CP4 ist glyphosatresistent - pflanzliche EPSP synthase aus z.B. Mais, die mutiert wurde 3. **Abbau/Inaktivierung** des Glyphosats durch nicht-pflanzliche Enzyme - G.Spaltung durch G.Oxidase - G.Modifizierung durch N-Acetyltransferase

Answer 34

**Glyphosat:** Totalherbizid Inhibiert die Biosynthese der aromatischen AS Tyrosin, Phenylalain, Tryptophan (Shikimatweg zur Synthese aromatischer AS) -> **Resistenzgene**: -> RoundupReady Soja (MON) A.t.Trafo, -> RoundupReady Mais (GA21) Biolistik Trafo **Phosphinotricin**: Totalherbizid Beeinflusst Stickstoffassimilation, in dem es kompetitiv Glutamin-Synthetase inhibiert -> Ammonium (NH4+) kann akkumulieren -> Zellgift -> **Resistenzgene**: *bar*-Gen (Bialaphos-resistent) / *pat*-Gen (Phosphinotricin-Acetyltransferase) aus verschiedenen Streptomyces-Stämmen => LibertyLink Baumwolle/ Reis (Agrobacterium/Biolositik Trafo)

Answer 35

Glyphosatresistenz: 60-100& der Herbizid resistenten transgenen Nutzpflanzen Danach: Phosphinotricin-Resistenz (z.B. Basta (in D verboten) oder Liberty Andere resistenzen: nur sehr vereinzelt

Answer 36

Nein -> konventionell gezüchtet Rapspollen chemisch mutagenisiert -> Pflanzen gezogen -> auf Herbizid selektioniert

Answer 37

ALS = Acetolatsynthase erstes Enzym in der Biosynthese verzeiwegter Aminosäuren Angriffspunkt für verschiedene Herbizide: -Imidazolinone - Phenylharnstoff - Triazolopyrimidine Punktmutationen bewirken Toleranzen gegenüber bestimmten oder allen ALS-Inhibitoren

Answer 38

*Bacillus thuringiensis* = Natürliches Insektizid Sporenbildendes Bakterium mit Insektiziden Proteinkristallen **Kristallproteine**: Cry-Protein, Bt Toxin, δ-Endotoxin - 400 bekannte Proteine in 55 Klassen - cry-Gene = Plasmid-codiert - cry-Proteine = sehr giftig für bestimmte Insekten Bsp. Cry-1-Klasse: gegen Schmetterlinge (Raupen) Cry-3-Klasse: gg Käfer Cry-10-Klasse: gg Dipteren

Answer 39

Sprühpräparate aus Sporen und Proteinkristallen - in Deutschland seit ca 40 Jahren im Einsatz - häufig im ökologischen Anbau (Bio-Bauern) - Marktanteil: Agrochemikalien 1%, biologische Bekämpfung 40%

Answer 40

1987 erste Klonierung einzelner Cry-Gene & Einsatz in transgenen Pflanzen - Expression bestimmter Cry-Proteine z.B. Cry1Ab gg Raupen des Maiszünslers, MON810 YieldGardMais Cry1Ac gg Raupe des Baumwollkapselbohrers MON531 BollgardBaumwolle - Sorten mit kombinierten Eigenschaften „stacked traits“ Bollgard II (Monsanto): Cry1Ac + Cry2Ab …

Answer 41

= Kombinierte Eigenschaften Kombination mehrere Cry-Gene oder/und Cry.Gene mit Herbizidresistenzen nehmen stark zu (2+17 77% der Anbaufläche transgener Nutzpflanzen) **SmartStax** (Monsanto & Dow) - 2 Herbizidresistenzen (Glyphosat, Phosphonotricin), 6 Cry.Gene -> 8 Transgene - Markteinführung SmartStax Mais 2010 USA & Kanada - Zulassung EU November 2013 als Futtermais

Answer 42

Herbizidresistenz Insektenresistenz Stacked Traits Krankheitsresistenz Input Traits Output Traits

Answer 43

Eigenschaften Zusammenhängend mit Anbau der Pflanzen („**Anbaueigenschaften**“) Dienen im allgemeinen der Ertragssteigerung /-Stabilisierung - Herbizidresistenz - Insektenresistenz - Krankheitsresistenz - Trockenheitsresistenz - … Gentechnische veränderte Pflanzen der ersten Generation fast ausschließlich mit Input Traits => nutzen v.a. Landwirt:innen

Answer 44

Produkteigenschaften Dienen im allgemeinen der **qualitativen Verbesserung** des Produktes - verbesserte Haltbarkeit (Lagerung, Transport) - verbesserte Zusammensetzung (mehr/neue Nähr-/Inhaltsstoffe) - einfachere Verarbeitung - … =>. Unzen Verbraucher:innen

Answer 45

Mais 844 Reis 672 Weizen 651 Kartoffeln 324

Answer 46

**Ziele:** 1. Schutz von Mensch, Umwelt und Sachgütern vor schädlichen Auswirkungen gentechnischer Verfahren und Produkte 2. schaffen eines rechtlichen Rahmens für die Erforschung, Entwicklung, Nutzung und Förderung der Gentechnik **geregelt wird** … Erzeugen von und arbeiten mit GVOs Freisetzen

Answer 47

**Freisetzung** - Freilandverscuhe mit GVOs für. Estimate Zeit an einem/ mehreren Standorten - genehmigende Behörden: BVL - öffentlich: Bekanntmachung & Anhörung - keine Verarbeitung für Lebensmittel / Futter **Inverkehrbringen** - kommerzielle Nutzung (Abgabe an dritte) einer gg-Pflanze - EU-weite Verfahren - Anbau der gv-Pflanze nach Freisetzungsrichtlinie der EU

Answer 48

Risiko = Eintrittswahrscheinlichkeit x Schadenshöhe **Risikowahrnehmung** - beeinflusst durch viele Faktoren (2 zentrale) 1. **Furcht** (korreliert mit Kontrollmangel, befürchteten Auswirkungen, Katastrophenpotential, Zunahme des Risikos über Zeit, tödliche Konsequenzen) 2. **Unbekanntheit** (korreliert mit Nichtbeobachtbarkeit, Neuheit, unbewusste, Ausgesetztsein, Mangel an Expertenwissen, verzagteren Konsequenzen)

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