Histologické metody

Question 1

Co je to ECM?

Ze kterých složek se skládá?

Answer 1

Extracelulární matrix (tekutina)

bohatá na Na(+) ionty, proteiny a ostatní organické látky

Question 2

Popiš jednotlivé postupy přípravy tkáně pro studium.

Jakým způsobem se získává tkáň pro mikrokopování?

Answer 2

Fixace, odvodnění, projasnění, prosycení, zalévání

krájení mikrotomem na jednotlivé řezy

Question 3

Popiš proces fixace

Answer 3

Malé kousky vzorku se rozpustí v organickém rozpouštědle, které denaturuje a sterilizuje proteinovou složku vzorku

mezi nejběžnější rozpouštědla patří formaldehyd a glutaraldehyd

Question 4

Popiš proces odvodnění

Answer 4

Stabilizovaný vzorek je rozpouštěn v roztocích se vzrůstající koncentrací alkoholu (až je nakonec rozpuštěn v čistém ethanolu, ve kterém se stane neprůhledným)

Question 5

Popiš proces projasnění

Answer 5

Do roztoku ethanolu je přidáno organické rozpouštědlo, tkáň je v roztoku znovu viditelná

Question 6

Popiš proces prosycení

Answer 6

Roztok organického rozpouštědla a ethanolu je smíchán s parafínem nebo pryskyřicí

za teploty 52-60°C dojde k prostoupení parafínu vzorkem (ztuhne)

Question 7

Popiš proces zalévání

a jeho následnému přikrojení

Answer 7

Parafínem obalený roztok se vloží do roztoku parafínu a nechá se ztuhnout

přebytečný ztuhlý parafín je odkrojen za vzniku parafínového bločku

Question 8

Jaký je klinický význam biopsie?

Jaké zařízení se na stabilizaci vzorku používá?

Answer 8

odhalení patogenních tkání na základě histologických vyšetření (vhodné např. při operacích nebo jako prevence)

zmrazení (kapalný dusík), krájení (kryostat) či obalení inertním kovem

Question 9

Jaké 2 základní skupiny barviv rozlišujeme?

Uveď zástupce u každé skupiny.

Vysvětli značku HE v souvislosti s těmito skupinami.

Answer 9

1. Bazofilní – reagují se záporně nabitými částicemi (fosfátové zbytky, záporně nabité proteiny)
2. Acidofilní (eosinofilní) – reagují s kladně nabitými částicemi (NH3(+) skupiny AMK (mitochondrie)

bazofilní – hematoxylin, acidofilní (eosinofilní) – eosin

HE – Hematoxylin-eosin zbarvení (hematoxylin barví fialově, eosin ružově až červeně)

Question 10

Jaký je princip PAS reakce?

Jakým zbarvením je cílová tkáň vybarvena?

Answer 10

Periodic Acid Shift – detekce hexos v sacharidech

purpurová až červenofialová

Question 11

Jakým způsobem lze detekovat lipidy ve vzorku?

Při jakém zpracování se naopak lipidy ztrácejí?

Answer 11

Zmrazenou tkáň nařezat na kryostatu a obarvit příslušným lipofilním barvivem, např. sudanovou černí.

Za vyšších teplot, působením organických rozpouštědel

Question 12

Jaké jsou 3 základní složky světelného mikroskopu?

Na které složce závisí zvětšení obrazu?

Answer 12

1. Kondenzor
2. Objektiv
3. Okulár

Na objektivu

Question 13

Co znamená zkratka CCD?

Answer 13

Charge-coupled-device

Question 14

Jaká je maximální rozlišovací schopnost světelného mikroskopu?

Lze světelným mikroskopem pozorovat jednotlivé mitochondrie?

Answer 14

přibližně 0,2 mikrometru

Ne, nejde. Mitochondrie jsou na to moc malé.

Question 15

Jaký je princip fluorescenční mikroskopie?
K čemu se využivá?

Co znamená zkratka DAPI?

Jaká barviva se pro fluorescenční mikroskopii používají?

Answer 15

Vzorek je ozářen zářením o krátké vlnové délce, které excituje elektron a vyvolá fluorescenci. Vyzařované světlo je pohlcováno mikroskopem a zobrazováno na černém pozadí (skrze speciální filtr).
Využití nachází zejména při identifikaci jaderných struktur – chromozomů, genů a molekul DNA.

4,4,-diaminido-2-fenolindol

akridinová modř (DNA, RNA), DAPI (DNA)

Question 16

Jak se od sebe liší konvenční světelná mikroskopie a mikroskopie s fázovým kontrastem?

Jak se od nich liší diferenciální interferenční kontrast (DIC)?

Answer 16

Histologické preparáty jsou průsvitné a mají stejnou optickou hustotu. Proto jsou neobarvené preparáty v konvenční světelné mikroskopii málo zřetelné. Mikroskop s fázovým kontrastem dokáže měřit různou energii světla (způsobenou odlišným lomem při průchodu vzorkem) a v důsledku toho lépe vykreslit snímek (tmavší a světlejší oblasti přímo úměrně intenzitě světla).

DIC je 3D verze mikroskopie s fázovým kontrastem

Question 17

Na jakém principu závisí konfokální mikroskopie?

K čemu se tato metoda hodí?

Answer 17

Kalibrovaný vzorek odráží světlo skrze čočku na zrcadlo, které světlo nasměruje na detektor. Ten je však ohraničen clonou, která propustí pouze úzký pruh záření – zvyšuje kvalitu obrazu.

K generaci 3D vzorků.

Question 18

Jaké jsou základní druhy elektronové mikroskopie?

V jakém parametru se liší?

Jaká je maximální rozlišovací schopnost elektronové mikroskopie?

Answer 18

1. TEM (transmisní elektronová mikroskopie)
2. SEM (skenovací elektronová mikroskopie)

Zatímco TEM vytváří 2D obraz, SEM vytváří 3D obraz

Okolo 3 nm.

Question 19

Jaký je princip TEM a SEM?

V čem mají výhodu oproti světelné mikroskopii?

Answer 19

1. TEM: Elektrony urychlené elektromagnetickým polem jsou pouštěny na vzorek. Některé elektrony skrze vzorek projdou a jiné se pohltí. Nepohlcené elektrony doputují na CCD a vytvoří 2D obraz.
2. SEM: Elektrony urychlené elektromagnetickým polem jsou pouštěny na vzorek (jejich průtok je regulován skenerem podobně jako v konfokálním mikroskopu). Odražené elektrony jsou absorbovány detektorem a vytvoří 3D obraz.

Mají řádově vyšší rozlišovací schopnost.

Question 20

Jaký je princip polarizační mikroskopie?

Které látky jsou viditelné v polarizačním mikroskopu?

Answer 20

Polarizované světlo prostupuje vzorkem, který světlo stáčí, a tak vytváří obraz.

Pouze opticky aktivní látky.

Question 21

Jaký je princip autoradiografie?

Které markery se zpravidla používají?

Answer 21

Radioaktivní látka emituje záření, které redukuje AgBr na Ag, které se ukládá v místech záření. Ložiska stříbra se pak vyskytnou na TEM nebo světelném mikroskopu.

Radioizotopy vodíku, uhlíku a dusíku.

Question 22

Jakým způsobem lze pozorovat tkáňové kultury?

Co to je primární buněčná kultura?

Kde nacházejí buněčné kultury uplatnění? Co to jsou HeLa buňky?

Answer 22

Pomocí světelné mikroskopie s fázovým kontrastem.

Jedna vrstva buněk na živném médiu po vložení do misky.

V patologii, virologii či genetice. První vypěstované buňky z rakoviny děložního krčku Henrietty Lacksové v roce 1951.

Question 23

K čemu slouží enzymová histochemie?

Jak je třeba vzorek pro tuto metodu připravit?

Jaký je mechanismus histochemické reakce?

Answer 23

K lokalizaci buněčných struktur pomocí specifické enzymové aktivity.

Enzymy snadno denaturují, proto je nejvhodnější zmražení a slabá fixace.

1. vzorek je ponořen do vhodného roztoku ze substrátem.
2. enzym reaguje se substrátem za vzniku produktu.
3. v případě bezbarvého produktu je do roztoku přidáno barvivo.
4. lokalizaci produktu lze pozorovat světelnou mikroskopií.

Question 24

Jakými způsoby lze vizualizovat specifické molekuly v tkáni?

Který způsob související s proteiny lze také aplikovat?

Uveď, s jakými molekulami reagují následující látky: faloidin, protein A, lektin

Answer 24

1. autoradiograficky
2. skrze fluorochromy
3. enzymaticky (nejčastěji peroxidáza)
4. těžkými kovy (Au, Pb apod.)

Imunohistochemie a hybridizační techniky skrze cDNA

1. faloidin – reaguje s aktinem
2. protein A – váže se na Fc protilátky (lokalizace buněčných struktur)
3. lektin – váže se na sacharidy (prezence glykoproteinů a sacharidů)

Question 25

Jaký je rozdíl mezi přímou a nepřímou imunohistochemickou metodou? | Do jaké rodiny proteinů patří protilátky? ## Footnote Jaký je rozdíl mezi polyklonálními a monoklonálními protilátkami?

Answer 25

1. Přímá metoda spočívá v tom, že do roztoku z označenou protilátkou se ponoří vzorek s antigenem. Označená protilátka se naváže na antigen a lokalizuje ho. Místa jsou viditelná ve světelném mikroskopu. 2. Nepřímá metoda spočívá v tom, že do roztoku s neoznačenou protilátkou se ponoří vzorek s antigenem. Neoznačená protilátka se naváže na antigen. Poté se přidá roztok s protilátkou proti protilátce (která je označená), ta se ve větší míře naváže na protilátku a zesílí jeho lokalizaci. Je také viditelná ve světelném mikroskopu. | Do rodiny imunoglobulinů (globulární proteiny). ## Footnote polyklonální protilátky – každá protilátka se váže na specifickou část proteinu monoklonální protilátky – protilátky mají nižší specifitu (váží se na více míst proteinu)

Question 26

Co znamená pojem in situ hybridizace? | Jak je třeba vzorek k této metodě připravit? ## Footnote K čemu je tato metoda dobrá? Jak by mohla tato metoda být použita pro diagnostiku HPV?

Answer 26

DNA podobná cDNA se s ní spojí (udělá dvoušroubovici) a nechá se proliferovat. Značená cDNA se pak lokalizuje. | DNA je třeba nejprve rozplést (denaturovat) a poté spárovat s cDNA. ## Footnote K nalezení specifické sekvcene DNA (geny), lokalizaci genu. Při diagnostice HPV je do buňky vložena cDNA pro HPV. Při prezenci HPV se cDNA spáruje a na mikroskopu jsou vidět charakteristicky zbarvená jádra.

Question 27

Co je tzv. artefakt? | V jakém rozlišení se zobrazí pod světelným mikroskopem tenké střevo? ## Footnote Které faktory mohou artefakt vytvořit?

Answer 27

Jedná se o porušený histologický snímek vlivem narušení zkoumané tkáně. | Ve 2D, pouze pomocí TEM a konfokální mikroskopie lze udělat 3D snímek. ## Footnote 1. smrštění buněk vlivem fixačních činidel (alkohol, formaldehyd, glutaraldehyd apod.) 2. teplo 3. ztráta buněčné hmoty (vlivem fixačních činidel) 4. přehyby řezů 5. sraženiny barviva