Hoofdstuk 3 Flashcards
(58 cards)
1
Q
Embryonale stamcellen ESC
A
- Bron: vnl embryo’s v enkele dagen oud
- Pluripotent
- Kunnen lange tijd gekweekt worden (veel telomerase activiteit)
- Toepassing: modelsysteem voor ziekten (mutatie)
- Nadelen:
> Etihische controverse
> Bij inspuiting in dier/mens
- Pre-differentiatie ndz, onbehandelde embryonale stamcellen injecteren kan kanker veroorzaken
- Onbehandelde ‘vreemde’ embryonale stamcellen injecteren kan afstotingsreactie veroorzaken
2
Q
Adulte stamcellen (Bron, Functie, …-potent, celdelingen en klinische toepassingen)
A
- Bron: beenmerg, bloed, vetweefsel, navelstrengbloed
- Herstelsysteen voor het lichaam
- Multipotent (veelzijdigheid afh van weefsel van origine) bv:
> Hematopoietische stamcellen: vormt verschillende bloedcellen
> Endothele stamcellen
> Neurale stamcellen
> Testiculaire cellen - Aantal celdelingen beperkt (geen telomerase)
- Klinische toepassingen:
> Stamceltransplantatie bij bepaalde kankers, immunodeficienties
> Autoloog (patient krijgt eigen stamcellen terug)
> Allogeen (patient krijgt stamcellen van donor)
3
Q
Geinduceerde pluripotente stamcellen iPSC
A
- Gedifferentieerde adulte cellen bv: fibroblasten uit huidbiopt
- Cellen gedwongen om te de-differentieren door toevoegen eiwitten belangrijk voor ES cel pluripotentie –> iPSC
- iPSC –> differentiatie mogelijk tot vele celtypes (pluripotent)
- Groeien goed (veel telomerase activiteit)
4
Q
Stamcellen (werkwijze)
A
- Aan primaire cellen eiwitten toevoegen die nodig zijn voor pluripotentie
- Ontstane geinduceerde pluripotente stamcellen verder behandelen met andere eiwitten om specifieke celtypes aan te maken bv: neuronen, hartcellen
- Verschillende eiwitcombinaties nodig per celtypes
5
Q
Stamcellen (voordelen)
A
- Kunnen als bron gebruikt worden om alle celtypes in vitro aan te maken
- Geinduceerde pluripotente stamcellen kunnen lang geexpandeerd worden
- Kunnen patient-specifiek gemaakt worden: modelsysteem voor ziekten (mutatie)
6
Q
Stamcellen (nadelen)
A
- Karyotype (chromosomen) moet gecheckt worden
- Differentieren tot een bepaald celtype nog niet goed gecontroleerd
- Variabiliteit van lijn tot lijn
- Weinig robuuste differentiatieprotocols
- Vereisen dure cultuurmedia
7
Q
Organoiden (bron, functie, wat en toepassing)
A
- Bron: afkomstig van primair weefsel, embryonale stamcellen of geinduceerde pluripotente stamcellen
- In staat tot zelf-hernieuwing
- 3D cellulaire cluster in een matrix (gel, membraan): meer differentiatie en zelf organizatie dan gewone 2D celcultuur in medium
- Toepassing: organ-on-a-chip, chip als matrix
8
Q
Organoiden (voordelen)
A
- Meer gelijkaardig en samenstelling en architectuur aan primair weefsel
- Voor verschillende weefsels mogelijk
- Makkelijk manipuleerbaar
- Kan lang in cultuur gehouden worden
- Stocks (cryopreservatie) mogelijk
9
Q
Organoiden (nadelen)
A
- Interactie met micro-omgeving (bv: immuuncellen) ontbreekt
- Complexere ziektemodellen blijven moeilijk na te bootsen
10
Q
Organoiden (voorbeeld)
A
- mini-brein
–> bron: ESC en iPSC
–> methode: air-liquid interface
11
Q
Weefselculturen (werkwijze, voorbeeld, voordelen en nadelen)
A
- Werkwijze: stukje primair weefsel afnemen van patient en in cultuur brengen
- Voorbeeld: huidweefsel in cultuur (skin explant)
- Voordelen:
> Behoudt cel-cel interacties
> Makkelijk manipuleerbaar - Nadelen:
> Beperkt houdbaar
> De-differentiatie
12
Q
Modelorganisem (wat)
A
Levensboom met evolutionaire afstand tot de mens, uitgedrukt als splitsing in miljoen jaren op basis van de gelijkenis van genen en eiwitten
13
Q
Modelorganismen (voordelen)
A
- Eenvoudigere fysiologie dan humaan in sommige organisemen
- Manipulatie mogelijk en eenvoudiger
- Makkelijk meetbare parameters
- Snel kweken
- Goedkoop
- Goede databanken
14
Q
Modelorganisme (nadelen)
A
- Verschillen tov mens
- Ethische vraagstukken
15
Q
Modelorganisme (mogelijkheden)
A
- Kunnen leiden tot inzichten in belangrijke fysiologische en ziekte-mechanismen
- Ontwikkelen van nieuwe behandleingen: goede voorbeelden, maar aandacht voor verschillen modelorganismen-mens
16
Q
Modelorganismen (ethische vraagstukken)
A
- Goedkeuring Ethische Commissie Dierproeven KU Leuven voor gewervelde modelorganismen
- Gepaste zorg
- Opleiding voor alle personeel en onderzoekers
- 3 V’s
> Vervangen van proefdieren door andere onderzoeksmethodes
> Verminderen van aantal proefdieren
> Verfijnen van de proeven voor beter dierenwelzijn
17
Q
Gist (Saccharomyces cerevisae) (wat)
A
- Bakkersgist/biergist
- Eencellig
- Meest eenvoudige eukaryote organisme: cellen hebben kern met chromosomen (DNA)
18
Q
Gist (voordelen)
A
- Kan makkelijk en goedkoop gekweekt worden
- Erg korte generatietijd: 1,5-2u bij 30°C
- Kan gemakkelijk genetisch geewijzigd worden (genetische modificatie)
19
Q
Gist (toepassingen)
A
- Studie van celdeling en geconserveerde cellulaire processen
- Studie van proteine-proteine interacties
- Aanmaak van recombinante eiwitten
> Voor onderzoek
> Als geneesmiddel bv: insuline
20
Q
Worm (Caenorhabditis elegans) (wat)
A
- Transparante nematode
- Komen voor als hermafrodiet of mannetjes
21
Q
Worm (voordelen)
A
- Kan gemakkelijk en goedkoop gekweekt worden op bacteriebodem
- Legt 300 (hermafrodiet) tot 1000 (bevruchting door mannetje) eieren, nieuwe generatie elke 3-4 dagen
- Levensverwachting 2-3 weken bij 20°C
- Kunnen makkelijk ingevroren en bewaard worden
- Transparant
- Één van de eenvoudigste organismen met een zenuwstelsel: hemafrodiet heeft 302 neuronen, volledig in kaart gebracht
22
Q
Worm (toepassingen)
A
- Goed model voor studie van celdeling (meiose) en celdood (apoptose), ontwikkelingsprogramma van alle cellen volledig in kaart gebracht
- Goed model voor studie met gewijzigde genexpressie: indompeling in oplossing van of injecteren met interferend RNA dat genexpressie stil legt, of voeden met getransformeerde bacterien die RNA tot expressie brengen
23
Q
Fruitvlieg (Drosophila melanogaster) (voordelen)
A
- Klein en makkelijk te groeien
- Kan gemakkelijk en goedkoop gekweekt worden op dieet van suikers en eiwitten
- Zichtbaar met blote oog
- Vrouwtjes leggen 100 tal eitjes per dag die na 12-15u uitkomen bij 25°C, nieuwe generatie elke 10 dagen
- Leversverwachting 30 dagen bij 29°C (langer bij koudere temperatuur)
24
Q
Fruitvlieg (toepassingen)
A
- Vormde de basis voor de ontdekking van de chromosomen
- Goed model voor ontwikkeling en genetica
- Mutagenese: genetische wijzigingen aanbrengen
- Transgenese: gen van andere diersoort inbrengen (fluorescente eiwit-merker)
25
Zebravis (Danip rerio) (voordelen)
- Vertebraat
- Klein: embryo 3,5 mm, volgroeid 4 cm
- Ontwikkelt snel: belangrijke organen gevormd 5 dagen na bevruchting, 3-4 maanden totvolgroeit
- Produceert veel eitjes 300-400 per week
- Embryo's ontwikkelen buiten moeder: makkelijk te bestuderen
- Embryo's zijn doorzichtig (fluorescente merkers)
26
Zebravis (toepassingen)
- Belangrijk model voor genetische studies en embryologie
- Grootschalige screenings met mutagenese: genen uitschakelen --> verband tussen gen en effect
- Grootschalige screenings door beinvloeden van genexpressie (RNA of morfolino's)
- Toxicologische studies
27
Kikker (Xenopus laevis en Xenopus tropicalis) (voordelen)
- 300-1000 eitjes per keer, ovulatie geinduceerd met hormonen
- Na ongeveer 4 maanden (tropicalis) of 12 maanden (laevis) volswassen
- Levensverwachting is enkele jaren
- Laevis eicellen zijn één van de grootste gekende cellen --> makkelijk te manipuleren en onderzoeken
- Eicellen en embryo's buiten lichaam en robuust --> ontwikkeling goed te observeren
28
Kikker (nadelen)
- Laevis genoom is zeer complex: minder geschikt voor genetische studies
29
Kikker (toepassingen)
- Veel gebruikt voor ontwikkelingsstudies
- Extracten van eicellen of embryo's gebruikt als cel-vrij model voor de studie van cellulaire processen
- Goed model om genexpressie te beinvloeden
30
Muis (Mus musculus) (voordelen)
- Relatief klein
- Reproduceren snel: 15 nakomelingen per worp, 1 worp per maand
- Cryopreservatie van embryo's is mogelijk
- Grote genetische gelijkenis met mens
- Grote fysiologische gelijkenis met mens
- Inteeltstammen zijn genetisch homogeen
31
Muis (nadelen)
- Relatief duur
- Muis is geen mens, belangrijke verschillen bv: immuunsysteem
- Geinduceerde ziektemodellen zijn slechts model voor bepaalde aspecten van ziekte bij mens, meestal niet representatief voor alle aspecten van de ziekte
32
Muis (toepassingen)
- Nieuwe mutanten kunnen makkelijk gegenereerd worden door bestraling, chemische mutagenese of transgenese of knock out/knock in
- Gehumanizeerde muismodellen, die een humaan eiwit produceren
- Studie als ziektemodel: vele ziekten bij mens komen spontaan bij muis voor, andere kunnen geinduceerd worden
33
Types muizenstammen
- Outbred vs inbred
- Recombinante stammen: kruising tussen 2 stammen
- Mutante stammen: bevatten een genetische wijziging
34
Andere genetische aspecten in vergelijking mens - modelorganismen
- Organisatie van chromosomen
- Organisatie van genen, volgorde op chromosomen
- Gelijkenis in genen/eiwitten
- Niet-eiwit coderend DNA
35
Xenograften (wat, voorbeeld, regels, voordelen en nadelen)
- Transplantatie van humaan weefsel in muis
- Voorbeelden van weefsel: primair weefsel of kankercellijn
- Muis moet immunodeficient zijn (anders afstoting van menselijk weefsel)
- Toestemming ethische commissie proefdieren en proefpersonen nodig
- Voordelen:
> Laat toe testen uit te voeren in vivo die op mens niet mogen/kunnen
- Nadelen:
> Artificieel: mens-muis / immuundeficient
> Relatief duur
36
Subcutaan
onderhuids
37
Orthotopisch
Op dezelfde plaats als in het oorspronkelijk weefsel
38
Staalbereiding
- = cruciale stap in het onderzoek
- De hoeveelheid van het staal bepaalt mede welke methode we kunnen gebruiken
- De kwaliteit van het staal bepaalt in grote mate de kwaliteit van de resultaten
> Vele componenten in biologische stalen zijn instabiel
> Voor sommige toepassingen moeten cellen levensvatbaar blijven
> Contaminatie vermijden
> Bewaring kan veranderingen induceren
- Studie-ontwerp: één specifieke toepassing nu versus biobank
39
Fysiologische vloeistoffen en cellen (staalname)
- Soms invloed van tijdstip, maaltijd, seizoen, ...
- Bloed hemaan, afhankelijk van hoeveelheid nodig:
> Venapunctie met vacuumtubes = 10-100 ml
> Vingerprik, hielprik = <0,05 ml
- Bloed muizen: staart of wang
- Cerebrospinaal vocht: ruggenmergpunctie of lumbaalpunctie
- Speeksel
- Urine
- Stoelgang voor microbioom
- Slijmvlies neus of keel
- ...
40
Fysiologische vloeistoffen en cellen (transport en verwerking)
- Temperatuur: kamertemperatuur, ijs, droogijs, ...
- Tijd tussen staalname en verwerking omwille van stabiliteit en wijzigingen, vaak binnen 2-4 uur
41
Bloedcomponenten
- Rode bloedcellen = erythrocyten --> geen kern
> Grootste fractie van bloedcellen (5x10ˆ9 cellen/ml bloed)
- Witte bloedcellen = leukocyten --> kern
> Polymorfonucleaire cellen = granulocyten: 60%
> Perifeer bloed mononucleaire cellen = PBMCs = monocyten en lymfocyten: 2x10ˆ6 cellen/ml bloed, meest relevante cellen voor meeste studies
- Plasma = vloeistof
> 50% van het bloedvolume
42
Keuze bloedtubes in functie van de studie
- Verschillende vacuumtubes afhankelijk van doelstelling
- Antistollingsmiddel = anticoagulans nodig?
> Serum: geen antistollingsmiddel of zelfs stollings versneller
> Plasma, cellen, ...: antistollingsmiddel nodig
- Keuze antistollingsmiddel:
> EDTA: DNA/RNA/eiwit, bloedcellen
> Heparine: klinische chemie, niet voor DNA/RNA (interfereert met PCR)
> Citraat: stollingsonderzoek
- Onmiddelijk RNA stabilisatie met RNA bewaarmiddel = RNA later
43
Plasma (staalbereidingsmethode)
Na centrifugatie van bloed in vacuumtube met anticoagulans
44
Serum (staalbereidingsmethode)
Zonder stollingsfactoren: na bloedstolling en centrifugatie, vacuumtube zonder anticoagulans of meestal speciale tube (versnelt stolling, scheidt serum en bloedklonter)
45
PBMC isolatie
Lymfocyten en monocyten uit bloed isoleren door centrifugatie, vaak startbasis voor verdere experimenten
46
Chirurgisch of dissectiespecimen (voor-, nadeel en voorbeeld)
- Biopsie = weefsel van levend organisme
- Voordeel: veel materiaal
- Nadeel: variabele en lange collectietijd, beperkte beschikbaarheid bij mens (post-mortem)
- Voorbeeld: lever, hersenweefsel
47
Endoscopisch (bij binnenin kijken) (voor-, nadeel en voorbeeld)
- Voordeel: minder invasief
- Nadeel: weinig materiaal
- Voorbeeld: stukje darmweefsel
48
Naaldbiopten (voor-, nadeel en voorbeeld)
- Voorbeeld: snelle afname
- Nadeel: weinig materiaal
- Voorbeeld: naaldbiopt van borst, tumor
49
Huid: incisie of punchbiopten (voordeel en voorbeeld)
- Voordeel: punchbiopt minder invasief
- Voorbeeld: voor fibroblasten
50
Transport en verwerking (weefsel)
- Temperatuur
- Tijd tussen staalname en verwerking
- Tijd tussen overlijden en staalname (bij post-mortem materiaal)
51
Bewaring (weefsels)
- Tijdelijk op ijs
- Eventueel stabiliseren van RNA bv: RNAlater
- Invriezen
- Fixeren van structuren: infiltreren met vloeistof en verharden
52
Organisatie (weefsels)
- Labelen
- Databank
- Bij humaan materiaal: ethische aspecten
53
Invriezen (weefsels) (principe, voor- en nadelen)
- Principe: invriezen in isopentaan gekoeld door vloeibaar stikstof (voorkomt vriesartefacten)
- Voordelen: laat snel verder onderzoek toe bv: cryocoupes
- Nadelen: reversibel, niet compatibel met alle toepassingen
54
Fixatie (weefsels) (wat, chemische fixatie, voor- en nadelen)
- = Stabiliseren van structuren om weefseldegeneratie te voorkomen
- Chemische fixatie
> Cross-linking fixatie: voorkomt covalente bindingen tussen eiwitten = aldehydes meest gebruikt
>> Formaldehyde oplossing = formaline
>> Glutaraldehyde
> Denaturerende fixatie: alcoholen
> Kwikverbindingen
> Oxiderende verbindingen bv: permanganaat
> Picrinezuur
- Microgolf straling: µsec - 2 min
- Voordelen:
> Laat bewaring van weefsel voor verder onderzoek toe
- Nadelen:
> Chemische fixatie realtief traag (opname door weefsel)
> Elke fixatie induceert chemische wijzigingen en artefacten, kan interfereren met verder onderzoek bv: formaldehyde beschadigt ook DNA/RNA
55
Verdere verwerking na fixatie
- Verharden van weefsel
- Coupes maken met microtoom
- Cyrocoupes
56
Verharden van weefsel (4 stappen)
- Dehydratie: behandeling met stijgende concentratie ethanol
- Xyleen bad om ethanol te verwijderen
- Inbedding in paraffine of epoxy hars
- Bewaren op kamertemperatuur voor vele jaren
57
Coupes maken met microtoom (na fixatie van weefsel)
- Dunne snedes weefsel maken
- Verschillende messen naargelang hardheid materiaal en toepassing (licht- of elektronenmicroscopie)
> Klassiek scheermesje
> Glas
> Diamant
> Laser
58
Cyrocoupes (na fixatie van weefsel) (5 stappen, voordelen, nadelen en toepassing)
- = coupes maken met cryotoom in compartiment met vloeibare stikstof voor ingevroren weefsel (cryomicrotoom of cryostat)
- Fixeren optioneel
- Inbedden in gepaste matrix
- Invriezen in isopentaan gekoeld door vloeibare stikstof
- Snijden met een cryomicrotoom
- Voordelen:
> Snelle processing
> Beter voor detectie van componenten die opgelost of gedenatureerd worden
> Detectie van enzymactiviteit
> Eiwitten, DNA, RNA kunnen later nog gebruikt worden
- Nadelen:
> Secties van lagere kwaliteit dan paraffine techniek
- Toepassing: snelle diagnostiek tijdens chirurgie
