Hoorcollege 4: Tijdlijn van Genome Sequencing

Question 1

In 1859 ‘the origin of species’ was published by…

Answer 1

Charles Darwin

Question 2

In 1865 Mendel published his experiments about…

Answer 2

Pea plants and heritance

Question 3

How long did it take to resolve the structure of the DNA double helix?

Answer 3

Almost a century

Question 4

When was the human genome completed?

Answer 4

2001

Question 5

Wie presenteerde voor het eerst het model van de DNA-dubbelhelix?

Answer 5

Watson en Crick

Question 6

Wat is de definitie van een kloon?

Answer 6

Een collectie van compleet identieke items

Question 7

Name several reasons/techniques why molecular cloning is important

Answer 7

Sequence analysis,
Genetic engineering (e.g. site-directed mutagenesis)
Express a protein for gene function analysis
Produce proteins / hormones for medical use
Make model systems with a defect in that gene
etc. etc.

Question 8

Op welke 3 manieren kunnen cloning vectors gebruikt worden?

Answer 8

• plasmiden
• fagen / virussen
• YACs en BACs

Question 9

Hoe beschermd een bacterie zijn eigen DNA tegen restrictie enzymen?

Answer 9

Door modificatie op de restrictie-sites

Question 10

Problem: Some human genes are too large to be cloned

into a plasmid (e.g. 200 kb). What is the solution?

Answer 10

1. Isolate mRNA (with a poly-A tail)
2. Make complementary DNA (cDNA) using reverse transcriptase
3. Clone cDNA fragments = a cDNA library

Question 11

Genomic library =

Answer 11

a collection of plasmids containing pieces genomic DNA

Question 12

A cDNA library =

Answer 12

a collection of plasmids containing pieces of cDNA

Question 13

Wat is er anders aan een dideoxy nucleotide vs een normale nucleotide?

Answer 13

De eerste OH-groep (vanaf 3’) is vervangen door een H

Question 14

Hoe wordt de methode waarbij er een dideoxy nucleotide wordt gebruikt genomed?

Answer 14

Sanger Sequencing

Question 15

Wat is het voordeel van radioactieve nucleotide tov dideoxy nucleotiden?

Answer 15

Om sentitieve detectie te hebben van de DNA bands

Question 16

Is cycle sequencing linear of exponentieel geamplificeerd?

Answer 16

Linear

Question 17

Wat was het voordeel van de ontdekking van fluorescente labeling?

Answer 17

1 buisje ipv 4

Question 18

What are the four steps of molecular cloning?

Answer 18

• First, a unique DNA fragment is inserted into a cloning vector (such as a plasmid) .
• The plasmid is then transferred into a bacterial cell .
• The single cell is allowed to grow to form a colony, containing millions of cells, each containing an identical copy of the inserted DNA .
• Finally, large quantities of cells can be harvested and the DNA isolated .

Question 19

What is the aim of molecular cloning?

Answer 19

Producing many identical copies

Question 20

Welke twee obstakels moesten worden overkomen om PCR toe te passen?

Answer 20

Er is een primer nodig (lastig als je de sequence niet weet) en moet gemixt worden in vloeistof

Question 21

Wat zijn polonies?

Answer 21

Identieke kopieën van een uniek DNA fragment

Question 22

Polonies is een combinatie van welke twee woorden?

Answer 22

Polymerase en colonies

Question 23

Hoe is Next-Generation Sequencing (NGS) anders dan eerste-generatie sequencing?

Answer 23

Er kan een massieve hoeveelheid monsters tegelijkertijd geanalyseerd worden in 1 mix

Question 24

Wat is Massively Parallel Sequencing?

Answer 24

Hetzelfde als NGS

Question 25

Wat zijn de 4 stappen van NGS?

Answer 25

1 . Sample preparation (=library construction) 2 . Template amplification 3 . Parallel sequencing 4 . Data analysis

Question 26

Wat houdt sample preparation in?

Answer 26

Eerst wordt het te onderzoeken DNA-fragment geïsoleerd uit het weefsel of uit de cellen waarvan het afkomstig is. Genomisch DNA wordt vervolgens gefragmenteerd, RNA zou eerst omgezet moeten worden in complementair DNA. Bij de DNA-fragmenten worden adapters (stukjes dubbelstrengs DNA met een bekende sequentie) toegevoegd, die m.b.v. ligase aan de uiteindes van de DNA-fragmenten kunnen binden. Voordat dit kan gebeuren wordt er eerst voor gezorgd dat mogelijke ‘enkelstrengs overhangs’ aan de uiteindes van de DNA-fragmenten worden weggehaald (DNA-polishing). Hierna wordt er aan ieder 5’ uiteinde een enkele nucleotide toegevoegd, deze nucleotide past precies op de adapter die vervolgens kan binden m.b.v. ligase. De adapters komen in dit mengsel in overvloede voor, om te voorkomen dat er te weinig adapters zijn voor al het DNA en zo ervoor te zorgen dat ieder DNA gebonden kan worden aan een adapter.

Question 27

Wat houdt template amplificatie in?

Answer 27

Bij deze stap is het van belang om het te onderzoeken DNA met gebonden adapters te amplificeren, zodat er heel veel kopieën ontstaan van de DNA-fragmenten. Hierbij wordt er gebruik gemaakt van de PCR-methode, hierbij zijn de primers complementair aan de sequenties van de adapters. Zo wordt elk stukje DNA geamplificeerd, ondanks het feit dat de sequenties van sommige DNA-fragmenten (nog) onbekend zijn.

Question 28

Wat houdt parallel sequencing in?

Answer 28

Er zijn hiervoor verschillende methodes, een van deze methodes is: sequence-by-synthesis methode. Hier worden alle vier de nucleotiden en DNA-polymerase toegevoegd bij de flow cell. Hierbij worden de vier nucleotiden gelabeled met elk een andere kleur fluorescentie. Wanneer er een nucleotide bindt die complementair is aan de DNA-streng die vastzit aan de flow-cell, wordt de streng bestraald met licht. Vanwege het fluorescentie label ontstaat er een bepaalde emissiegolf die een computer kan opvangen en kan lezen als een van de vier kleuren. Per cyclus kan er 1 nucleotide aan toegevoegd worden, dus wordt de lengte van streng bepaald door het aantal cycli. Als het binden van nucleotiden compleet is, laat de nieuwe streng los.

Question 29

Wat houdt data analyse in?

Answer 29

De nieuwe gesynthetiseerde strengen/sequenties worden door de computer geanalyseerd om zo overlappingen in sequenties te herkennen. Hoe meer overlappende sequenties, hoe vaker een nucleotide door de computer gelezen is. Meestal krijg je uit deze analyse té veel informatie, specifieke informatie wordt eruit gefilterd a.d.h.v. speciaal ontworpen computerprogramma’s.

Question 30

Waar staat WES voor?

Answer 30

whole exome sequencing

Question 31

Wat gebeurd er bij WES?

Answer 31

Eerst wordt het genetische DNA van de patient verrijkt voor alle coderende sequencen, en dan wordt dit volledig gesequenced.

Question 32

Wat zijn andere vormen van WES?

Answer 32

RNA sequencen en niet-invasieve prenatale testing (NIPT)

Question 33

Hoe veel kostte het HUGO (human genome project) ongeveer?

Answer 33

2.7 biljoen dollar