HPLC Flashcards
Bedeutung der eluotropen Reihe
In der Chromatographie auf einer polaren stationären Phase
(z.B. unmodifiziertem Kieselgel):
• werden polare Substanzen stärker zurückgehalten als
unpolare;
• nimmt die Elutionskraft des Lösungsmittels (= der mobilen
Phase) zu, je weiter dieses unten in der eluotropen Reihe
steht;
• werden die Retentionszeiten der zurückgehaltenen
Substanzen umso kürzer, je stärker die Elutionskraft der
mobilen Phase ist Bei der Chromatographie auf einer unpolaren stationären
Phase kehren sich alle Aussagen um ! Es gilt generell: „Gleich und gleich gesellt sich gern“
Papier- und Dünnschichtchromatographie
Prinzip
Prinzip: Chromatographie auf ebenen, dünnen Schichten als stationäre Phase: Papier oder z.B. Kieselgel, Aluminiumoxid, etc. das auf Glasplatten oder Alufolien aufgebracht wird
Typische stationäre Phasen der PC:
- wäßrige Phasen (Wasser wird gut von Cellulose adsorbiert; zur Auftrennung polarer Analyten)
- hydrophile Phasen: Imprägnierung von Cellulose mit Methanol, Formamid, Glycol, Glycerin…
- hydrophobe Phasen: Papier muß zuerst acetyliert und dann mit Siliconöl imprägniert werden zur Verwendung aromatischer oder aliphatischer KW als mobile Phase
Typische mobile Phase PC
Isopropanol / Ammoniak / Wasser • n-Butanol / Essigsäure / Wasser • Wasser / Phenol • Formamid / Chloroform • Formamid / Chloroform / Benzol • Formamid / Benzol • Formamid / Benzol / Cyclohexan • Dimethylformamid / Cyclohexan • Paraffinöl / Dimethylformamid / Methanol / Wasser
Papier- und Dünnschichtchromatographie
Detektion:
- nach Verwendung von Sprühreagenzien (z.B. Ninhydrin für Amine)
- durch Verwendung von Fluoreszenzfarbstoff
- imprägnierten DC-Platten
- durch Reflexionsmessung (vergl. UV/VIS-Scanner)
Charakteristika der DC und Vorteile gegenüber der LC:
- Alle Trennprinzipien realisierbar
- Schnellere Trennung
- Gute Empfindlichkeit
- zahlreiche Detektionsmöglichkeiten (direkt/indirekt, mit/ohne Reaktion; spektroskopisch) -Qualitative und quantitative Analyse
- Minimale Probenvorbereitung (da Trennmedium Verbrauchsmaterial)
Säulenchromatographie
(Flash-Chromatographie)
Charakteristika:
…einfache Absorptionschromatographie …besonders zur routinemässigen
Reinigung organischer Substanzen
geeignet
…Methode mit mittlerer Auflösung …eignet sich sehr gut zur raschen
(~1/2 Std.) und daher preiswerten
Auftrennung grosser Substanzmengen
(~10 g)
…Stationäre Phase: meist Silicagel 60 in
der Korngrössenverteilung 40 – 63 μm
Hochdruck-/Hochleistungs-Flüsigkeitschromatographie (HPLC)
Prinzip
Gleichgewichtseinstellung ist diffusionskontrolliert (niedrigere Diffusionskoeffizienten in der flüssigen Phase !) ÖVerwendung von Trägermaterialien mit
- möglichst kleinem Durchmesser und
- möglichst gleichmäßiger Form Limitation: Druckabfall in der Säule ! ÖBeschichtung mit selektiver Trennphase an der
Oberfläche des Trägermaterials (chemische
Modifikation, typischerweise: Silanisierung)
HPLC - Gradientensysteme
• Elutionsmittelgradient: Zusammensetzung der
mobilen Phase wird von niedriger zu hoher
Elutionskraft gesteigert => Trennleistung verbessert
• Isokratische Elution = konstante
Laufmittelzusammensetzung
=> Stark zurückgehaltene Verbindungen eluieren erst
nach langer Zeit
=>Und als sehr breite Peaks • durch Erhöhung der Elutionskraft des Laufmittels wird
die Elution beschleunigt
=> Substanzen eluieren früher und als schmälere
Peaks
• Zur Erzeugung derartiger Lösungsmittel-Gradienten
gibt es Niederdruck- und Hochdrucksysteme
• Niederdrucksysteme
– Über getrennte Pumpen verschiedenene Laufmittel
niederdruckseitig vorgemischt, dann mit Hochdruckpumpe verdichtet und über die Trennsäule gefördert
– Nachteil: großes Totvolumen des Systems durch
Verwendung einer Mischkammer
• Hochdrucksysteme
– Mischung der Elutionsmittel erfolgt direkt über eine
Hochdruckpumpe – saugseitig mit Proportional-Schaltventil ausgestattet – öffnet mit hoher Frequenz die Leitungen im Verhältnis der
gewünschten Laufmittelzusammensetzung – Vorteile: einfachere Handhabbarkeit, fast totvolumenfrei Ö
reproduzierbarer einstellbare Gradienten
HPLC - Probenaufgabe
…Über Probeneinlaßsystem erfolgt die Probenaufgabe …drucklos über ein Sechsweg-Ventil …”Load”-Position: Probenschleife (bekanntes V=const.) befüllt …”Inject”-Position: Probe wird aus Probenschleife auf Säule
aufgebracht …Typische Injektionsvolumina: 1 bis 50 µL
HPLC – Stationäre Phasen
…Bei normal phase-(NP-)Chromatographie:
Bei normal phase-(NP-)Chromatographie:
– Laufmittel relativ apolar (z.B. Hexan, chlorierte Lösungsmittel,
– stationäre Phase relativ polar (unmodifiziertes Kieselgel
(SiO2) oder Aluminiumoxid (Al2O3) …Adsorptive Wechselwirkungen der Analyten mit freien
Silanol-Gruppen oder der hydratisierten Oberfläche des Al2O3 führen zur Trennung
ÖTrennvorgang stark abhängig vom Wassergehalt der
chno
E. R
Probe
– kann zur Hydratisierung der Oberfläche der stationären
Phase ÖVeränderung ihrer Retentionseigenschaften führen
is
©
…Anwendungsgebiet der NP-HPLC zu großem Teil von
GC abgedeckt Öheute untergeordnete Bedeutung …NP-HPLC heute v.a. für präparative Zwecke
HPLC – Stationäre Phasen
…Bei der reversed phase-(RP-)Chromatographie
– Laufmittel polar: Gemische von Wasser und Methanol
oder Acetonitril – stationäre Phase apolar: Polarität des Silica-
Trägermaterials an seiner Oberfläche modifiziert. – Einsatz von Silanen mit z.B. Phenylgruppen oder
Alkylgruppen verschiedener Kettenlänge (C 2-bis C18-
Silane) Övermindert starken Einfluß des Wassergehaltes auf die
Trennung, – Retentionsvermögen für apolare Analyten nimmt mit
größer werdender Kettenlänge zu
E. R
…(RP-)HPLC ist wichtigste Einsatzform der HPLC
Brechungsindex-(RI)-Detektor
…detektiert die Elution eines Analyten durch Messung
des Brechungsindex (“refractive index”, RI) des
Eluats …Bei chemisch und physikalisch ähnlichen
Substanzen ist die Differenz der Brechungsindizes
Δn zwischen dem Gemisch nG und dem reinen Laufmittel nL in erster Näherung proportional zur Konzentration c des gelösten Stoffes:
Δn= nG - nL = (nProbe -nL) . c
Brechungsindex-(RI)-Detektor: Gerätetechnik
…RI-Detektion
…in Reflexions-Technik oder
…nach dem Ablenk-(Deflexions-)Prinzip …In beiden Fällen: Brechungswinkel an einer
Phasengrenzfläche abhängig von Brechungsindizes der beiden aneinander grenzenden Medien
…Brechungsindex-Änderung eines Mediums
ÖÄnderung des Brechungswinkels …Registrierung durch eine Abnahme der
Lichtintensität an einem Detektor (Photodiode)
oder anhand der Verschiebung des Lichtspots
entlang einer photosensitiven Oberfläche (DAD)
Ablenkungsprinzip RI-Detektor
Ablenkungsprinzip:
- unterschiedlich weite Ablenkung des Lichtstrahls in seiner Position, abhängig vom Brechungsindex der Probe im Probenkompartiment.
- Änderung des Brechungsindex und damit der Auslenkung konzentrationsproportiona
