immunobolt 1

Question 1

but immunobolt

Answer 1

donner des info sur les proteine, detecter des proteine

Question 2

ckoi electrophorese

Answer 2

L’électrophorèse fait référence à la migration d’une particule chargée sous l’influence d’un champ électrique.
.

Question 3

cmt les particule migre ds le gel de l lectrophorese et prk

Answer 3

Puisqu’on utilise une matrice de migration nonhomogène (le gel de polyacrylamide) et qu’on homogénéise grâce à l’ajout de SDS la charge de toutes les molécules de la solution, celles-ci migreront dans le gel en
fonction de leur poids moléculai

Question 4

SDS-^page ckoi

Answer 4

on utilise une matrice de migration nonhomogène (le gel de polyacrylamide) et ensuite on l’homogénéise grâce à l’ajout de SDS la charge de toutes les molécules de la solution,

Question 5

apre la resolution des proteine sur le SDS-page keski est possible de faire

Answer 5

il est possible de les transférer sur une membrane, afin de permettre leur détection immunologique.

Question 6

immunoblot c kel deu technic

Answer 6

c gel sds-page et membrane

Question 7

le gel polyacrilamide c une tevh ki repose sur koi

Answer 7

Cette technique repose sur la polymérisation de monomères d’acrylamide,

qui sont reliés entre-eux par l’incorporation de co-monomères bi-fonctionnels de
bisacrylamide,

créant ainsi un tamis tri-dimensionnel à travers duquel les protéines migreront.

Question 8

Les concentrations d’acrylamide et de bisacrylamide dictent
respectivemen koi

Answer 8

t la longueur des chaînes d’acrylamide et l’étendue de leur réticulation.

Question 9

En pratique, on exprime la concentration de polyacrylamide sous la forme

Answer 9

%T, %C,

Question 10

T et C represente koi

Answer 10

ù T représente la concentration totale de monomère (acrylamide + bisacrylamide)

et C, le pourcentage de monomère T totaux provenant de la bisacrylamide.

Question 11

les concentration de acrylamide et bisacrylamide influence koi

Answer 11

Ces concentrations influencent la densité, l’élasticité, la force mécanique et la taille des pores du gel.

Question 12

il est donc relativement aisé de modifier la taille des pores du
gel en modifiant

Answer 12

les proportions d’acrylamide et bisacrylamide contenues dans le gel.

Question 13

La polymérisation de l’acrylamide et de la bisacrylamide est initiée par

Answer 13

des catalyseurs, soit le persulfate d’ammonium (APS) et le TEMED.

Question 14

APS vs TEMED diff

Answer 14

Les radicaux libres du APS
catalysent la polymérisation de l’acrylamide et de la bisacrylamide,

tandis que le TEMED accélère le taux de formation de radicaux libres du APS

Question 15

La propriété
hygroscopique du APS cause

Answer 15

sa dégradation presqu’immédiatement au contact de l’eau, ce qui justifie sa préparation extemporanée (préparation fraîche)

Question 16

des sol a kel temp on doi utiliser lors de l lectrophorese

Answer 16

Lors de la préparation d’un gel d’électrophorèse, on devrait toujours utiliser des solutions à température de la pièce, préparées avec de l’eau distillée ou désionisée
et dégazées. L

Question 17

La polymérisation d’un gel de polyacrylamide est un processus cmt

Answer 17

exothermique, qui peut être influencé par la température ambiante et l’oxygène
atmosphérique

Question 18

temp de polymerisation

Answer 18

Bien qu’après 15-20 minutes le mélange ait commencé à gélifier, la polymérisation se poursuit pendant environ 2 heures

Question 19

Le pourcentage d’acrylamide utilisé pour la confection du gel est dicté par

Answer 19

r la taille des protéines de l’échantillon.

Question 20

La mobilité relative (R ) des protéines dans le gel est cmt

Answer 20

inversement proportionnelle au logarithme de leur poids moléculaire (M )

Question 21

on doit choisir un pourcentage d’acrylamide qui permettra à la protéine d’intérêt de

Answer 21

1-migrer au moins jusqu’au tiers du gel dans le temps requis pour que le front de migration atteigne le bas du gel.
2-qui permette la manipulation du gel une fois l’électrophorèse terminée,
3-ainsi que le transfert efficace des protéines vers une membrane, afin de
procéder à l’immunoblot.

Question 22

. En règle générale, plus le pourcentage d’acrylamide est faible et que le gel est mince, plus

Answer 22

le transfert sera efficace

Question 23

un gel trp mince sera facilemen manipulable

Answer 23

fau . Par contre, un gel trop
mince sera difficilement manipulable.

Question 24

SDS CKI

Answer 24

un puissant dénaturant de protéines. Il s’agit d’un détergent anionique

Question 25

role SDS

Answer 25

ui permet, d’une part,
-de solubiliser les protéines de l’échantillon,

-et d’autre part, d’appliquer une charge négative constante par unité de masse,

— en s’enrobant autour de la structure du polypeptide.

Question 26

tous les polypeptides liés au SDS possèdent

Answer 26

t la même conformation hydrodynamique et la même charge, leur conférant ainsi le même potentiel électrophorétique, à
l’exception de leur taille moléculaire. L

Question 27

L’ajout du 2-mercaptoéthanol, couplé au chauffage des échantillons, perme

Answer 27

t la réduction des ponts disulfures et la dissociation
des polypeptides, ce qui « ouvre » leur conformation et permet la liaison complète du SDS sur ceux-ci. D

Question 28

Dans la méthode Laemmli, on coule u

Answer 28

un gel de compactage
au-dessus du gel de séparation, ce qui permet à l’échantillon de se compacter et se concentrer avant de pénétrer dans le gel de séparation,

ce qui améliore ensuite
la résolution et la séparation des polypeptides lors de la migration.

Question 29

keskon doi faire o proteine avan leur chargement

Answer 29

Il est très important de doser les protéines avant leur chargement dans les puits. E

Question 30

le chargement de plus de 30 µg de protéines totales/mm créera un

Answer 30

a un effet de distorsion et pour une protéine particulière, cette limite ne devrait pas excéder 0,3
µg/mm .

Question 31

Pour faciliter le chargement des échantillons dans les puits, on ajoute habituellemen koi

Answer 31

ne faible quantité de glycérol et de bleu de bromophénol dans le tampon
réducteur.

Question 32

glycerol ajouté fai koi

Answer 32

Le glycérol augmente la densité de l’échantillon, ce qui facilite son chargement dans les puits

Question 33

coloration permet koi

Answer 33

t la coloration permet de suivre l’évolution de la migration,
en plus de permettre le calcul du R des protéines (la mobilité d’une protéine divisée par la mobilité du front de migration)

Question 34

ki migre plus rapidemen ke tout les otre molecule

Answer 34

Puisque le bleu de bromophénol est une
très petite molécule anionique, elle migrera plus rapidement que toutes les autres, formant ainsi le front de migration.

Question 35

Une fois la migration des protéines terminées, tel que déterminé par la position du front de migration, keskon fai

Answer 35

on peut colorer le gel pour les visualiser ou les transférer surune membrane de PVDF (polyfluorure de vinylidène) pour les détecter immunologiquement. Toutefois, on ne peut faire les deux avec le même échantillon. Si on doit
faire les deux techniques avec un même échantillon, il faut prévoir le charger dans deux puits, un pour chaque technique

Question 36

Pour la coloration des protéines sur le gel, on utilise

Answer 36

une solution de bleu de Coomassie R250

Question 37

cmb de volume de coloration on doi use

Answer 37

0. On doit utiliser 10X le volume du gel pour la coloration, afin de s’assurer
   de diluer le SDS qui pourrait faire compétition aux protéines pour la liaison au colorant.

Question 38

e. L’éthanol 40%, l’acide acétique 10% et l’eau distillée 50% contenus dans la solution de coloration causent

Answer 38

t la précipitation des
protéines dans le gel, afin d’éviter leur fuite du gel vers la solution de coloration

Question 39

t. La sensibilité de cette méthode de détection est

Answer 39

d’environ 1 µg de protéine et
la coloration est non-réversible.

Question 40

Le transfert des protéines sur une membrane de PVDF se fait cmt

Answer 40

également par application d’une charge électrique.

Question 41

imp de manipuler la mbr cmt

Answer 41

Il est très important de toujours manipuler la
membrane à l’aide de pinces et de toujours porter des gants

Question 42

prk gan kd on manipule mbr

Answer 42

. Les huiles de la peau empêchent le mouillage adéquat de la membrane et les protéines à la surface de
la peau se fixent à la membrane

Question 43

mbr proteger par koi

Answer 43

pour cette raison, la membrane est protégée entre deux feuilles de papier bleu jusqu’à son utilisation. On la manipule donc toujours
avec des pinces, en limitant au maximum la surface de contact.

Question 44

cmb de proteine peuve se fixer sur mbr

Answer 44

Environ 150 µg de protéines peuvent se fixer par cm de membrane de PVDF qui possède des pores de 0,2 µm

Question 45

cmt doi etre la membrane avan son utilsation

Answer 45

. La membrane de PVDF doit être activée avant sonutilisation : on la mouille tout d’abord dans de l’alcool 100% avant de l’équilibrer dans le tampon de transfert.

Question 46

Le gel de polyacrylamide et la membrane de PVDF sont
ensuite mis cmt

Answer 46

en sandwich entre deux papiers absorbants pour ensuite être placés entre une anode et une cathode dans le module de transfert.

Question 47

Les protéines,
chargées négativement par le SDS, sont attirées vers

Answer 47

’anode (électrode positive

Question 48

donc proteine de gel face a mbr + charge fon koi

Answer 48

). Elles quittent donc le gel et sont arrêtées par la membrane de PVDF, où elles se
lient par des interactions hydrophobes.

Question 49

Sur la membrane, contrairement au gel de polyacrylamide, il est possible de m

Answer 49

e marquer les protéines totales, aussi bien que des protéines particulières, et ce à l’aide
d’anticorps spécifiques.

Question 50

par kel deu methode on marque les proteine total

Answer 50

-La première, la coloration au Ponceau S, est
réversible. L
-e. La
deuxième est la coloration à la NHS-biotine.

Question 51

coloration panceau s c cmt

Answer 51

Le colorant se fixe aux régions non-polaires des protéines et sert dans notre protocole à vérifier l’efficacité du transfert des protéines sur la membrane

Question 52

cmt on fai coloration NHS biotine

Answer 52

1. On incube d’abord la membrane avec la NHS-biotine.
2. On ajoute ensuite la streptavidine couplé à la peroxydase de raifort (HRP).
3. On termine avec l’ajout du substrat (luminol), qui mène à la réaction de chemiluminescence, détectable avec le système Amersham Imager, équipé d’une caméra
   CCD.

Question 53

La NHS-biotine se fixe de façon irréversible a ki

Answer 53

aux résidus lysines ou au N-terminus des polypeptides qui ont migrés dans le gel et qui ont été transférés sur la
membrane.

Question 54

La streptavidine est une protéine qui se fixe a

Answer 54

e avec grande affinité à son ligand, la biotine

Question 55

Le complexe formé par la streptavidine et la biotine possède

Answer 55

e la plus forte
interaction non-covalente connue entre une protéine et son ligand.

Question 56

La peroxydase de raifort (HRP) est une enzyme qui a

Answer 56

agit sur le substrat utilisé pour la révélation

Question 57

La peroxydase catalyse

Answer 57

’oxydation du luminol.

Question 58

En présence d’amplificateurs chimiques et de catalyseurs, lA lumiere est cmt

Answer 58

l’intensité de lumière et sa durée d’émission est
augmentée : c’est la réaction de chemiluminescence augmentée (enhanced chemiluminescence – ECL). L’ECL est une méthode de détection sensible, où la
quantité de lumière émise est proportionnelle à la quantité de protéine détectée.

Question 59

marquag prot specific 4 etape