Immunochemische und molekularbiologische Verfahren Flashcards
(12 cards)
Allgemein
immunchemisch / molekularbiologisch
Immunochemische Verfahren Nutzen die Funktionsweise des Immunsystems Fremde Zellen (Antigene) gelangen in das System, der Körper reagiert darauf
Molekularbiologische Verfahren nutzen in der DNA enthaltene Nukleinsäuren anhand derer mittels PCR die aufschlüsselung erfolgt.
Antigen
Detektion des Analyten beruht auf Antigen - Antikörperreaktion
Hohe Spezifität der Antikörper gegenüber dem Antigen
Antikörper
- Werden im Rahmen der Immunantwort von Plasmazellen gebildet, um in den Organismus eingedrungene, körperfremde Proteinstrukturen zu erkennen und unschädlich zu machen
- Bindung des Antikörpers an das Antigen (Schlüssel-Schloss-Prinzip)
- Ausbildung eines Komplexes
- Paratop: Variabler Molekülbereich, der das Antigen erkennt und mit ihm in Verbindung tritt
- Eptiop / Antigene Determinante: Bindungsstelle des Antigens
Antikörper monoklonal
- Reagieren ausschließlich mit einem Epitop des Antigens
- Gewinnung auch durch Immunisierung des Tieres, jedoch Entnahme der B-Lymphozyten aus Milzzellen
- Verschmelzung in vitro mit Krebszellen (Myelom) -> Hybridomzelllinien
- Auswahl der Hybridomzelllinie, die am besten das gewünschte Epitop bindet
- Hybridomzellinieen können sich beliebig oft teilen und einen bestimmten Antikörper bilden
Antikörper polyklonal
- Gewinnung im Versuchstier (Maus, Kaninchen) durch Spritzen eines Antigens
- Immunsystem erkennt Fremdstoff und bildet daraufhin Antikörper
- Aufbereitung des abgenommenen Blutes -> Antikörper in Serum
- Mischung von Immunglobulinen mit unterschiedlicher Spezifität und Affinität
- polyklonale Antikörper erkennen unterschiedliche Epitope des Antigens
Sandwich Elisa
- Verwendung von 2 unterschiedlichen Antikörpern, die beide an das zu analysierende Protein, aber an unterschiedliche Eptiope binden
- Antikörper 1 (primärer Antikörper) ist an der Festphasenoberfläche immobilisiert –> Antigen bindet an Festphase -> alle anderen Bestandteile lassen sich durch Waschschritte entfernen
- Ausbildung des „Sandwichs“ durch Zugabe und Bindung des Antikörpers 2 (sekundärer Antikörper)
- Der sekundäre Antikörper ist enzymmarkiert -> Detektion kann über enzymatische Reaktion erfolgen
- Die Menge des entstehenden farbigen Produktes, dessen Bildung durch das Enzym katalysiert wird ist zur ursprünglichen Menge an Antigen
Kompetitiver Elisa
• Dem primären Antikörper werden gleichzeitig 2 Antigene angeboten a) FestphasengebundenesAntigen
b) AntigenhaltigeProbe
• Anschließend wird wieder der enzymmarkierte Antikörper 2 hinzugegeben, der eine Farbreaktion verursacht
• Antigengehalt in der Probe ist umgekehrt zur Farbintensität (je mehr Farbe desto weniger Antigen)
• Anwendung v.a. wenn das zu quantifizierende Antigen nur schlecht an die Festphase bindet
Endpunkt PCR
Spezifische Amplifikation eines DNA-Abschnittes mit anschließender Detektion der Produkte
Denaturierung:
Isolierte doppelsträngige DNA wird bei 95 °C in die komplementären Einzelstränge gespalten
Annealing:
• Beim Abkühlen auf ca. 50-60 °C binden die zugesetzten Primer an die DNA
• Primer: zwei Oligonucleotide (ca. 20 bp), die die komplementären Sequenzen des zu ampflifizierenden Bereichs darstellen und diesen begrenzen
Elongation:
DNA-Polymerase synthetisiert den eingegrenzten DNA-Abschnitt -> Verdopplung der DNA
Real Time PCR
- Fortschritt kann während des Ablaufs der PCR überwacht warden
- Daten stehen zu jederzeit zur Verfügung nicht erst am Ende
- Reaktionen werden anhand des Zeitpunkts der vervielfältigung charakterisiert, bei denen die amplifikation eines Ziels erkannt wird
Trennprinzip Real Time PCR
Messgröße: Wanderung von geladenen Teilchen im elektrischen Feld
- Wanderungsgeschwindigkeit abhängig von Ladung und Molekulargewicht -> Trennung
Agarosegelelektrophorese
- v.a. zur Auftrennung von DNA-Fragmenten, aber auch RNA oder hochmolekularer Proteine
- DNA meist negativ geladen -> deshalb Wanderung im elektrischen Feld
- Trennung nach molekularer Masse
- DNA-Längenstandards (bekannte Längen) können als Marker-Standards verwendet werden
Sichtbarmachung
Elektrophorese
- Durch Interkalationsfarbstoff Ethidiumbromid
- Schwache Fluoreszens wird durch Wechselwirkung mit einem Nucleinsäuremolekül erhöht
- Anregung: 254 nm, 302 nm oder 366 nm; Emission: 500-590 nm
- Nachweisgrenze: 1 ng DNA
