intro diagnostic moléculaire Flashcards

Question

v ou f | les polymérase dans PCR sont infaillible, ne sont jamais responsable de mutations

Answer 1

f | taux d'erreur pour chaque

Answer 2

délétions / insertions qu'on spot par électrophorèse ou puits où signal selon son changement de taille

Answer 3

insertions/délétions récurrentes ou analyses d'identité génétique (contamination foeto-maternelle ou judiciaire ou insatbilité microsatellites)

Answer 4

enzyme de restriction coupe le produit de PCR à un site spécifique. si séquence mutée: enzyme ne coupe pas: séquence plus longue qu'à la normale pcq site de restriction abolit, spot par électrophorèse la mutation abolit ou crée un site de restriction

Answer 5

mutations ponctuelles récurrentes

Answer 6

amplifie par PCR amorces fluo: si ça match 3' => extension, sinon, si ça mismatch 3' on bloque l'extension là DÉTECTE LES SNP (++)

Answer 7

électrophorèse sur gel + précis (détecte avec fluorescence, mesure différence de 1 nucléotide) 1. PCR amplifie 2. Dénaturation 3. Réamplifie un mix de nucléotides normaux et modifiés (marqués par fluo) les nucléotides modifiés = ddNTP = pas de OH au ribose donc empêche la poursuite de l'élongation. On bloque l'élongation de la séquence à plusieurs endroits différents (pour ça qu'on amplifie la même séquence) par exemple, à tous les G. On peut donc voir par électrophorèse tous les endroits où il y a des G dans la séquence et détecter un SNP. (mais aléatoire, pas précis à un nucléotide) on essaie de faire un stop à toutes les pb pour dresser un portrait général de la séquence

Answer 8

didésoxyribonucléotide est un nucléotide dont les groupements 2'OH et 3'OH du ribose sont absents: inhibe l'élongation de la séquence par polymérase (3') parce que sans OH au C3 du ribose, le prochain dNTP ne peut pas se lier: CHAIN TERMINATION.

Answer 9

pas besoin de savoir exactement la mutation qu'on cherche

Answer 10

b) séquençage nouvelle génération

Answer 11

- quand ++ mutations dispersées aléatoirement dans le gène - cas de SUBSTITUTION - petites insertions/ délétions - PAS grandes anomalies de dosage

Answer 12

pcr-migration (électrophorèse) petites: Sanger (mais pas grandes) TaqMan; PCR en temps réel (??) MLPA (dél & dup)

Answer 13

Sanger | Allele Specific Primer Extension

Answer 14

pcr-digestion

Answer 15

pcr-migration

Answer 16

électrophorèse capillaire | Buvardage Southern

Answer 17

détection simultanée des produits (on peut voir en temps réel si la polymérase fait une erreur de copie/recombi) permet la discrimination allélique (amorce et sonde marquées) & quantification relative/absolue (seuil quantitatif de fluorescence commun pour tous les patients testés) comme PCR mais moins de manipulation

Answer 18

PCR temps-réel reporteur fluo à l'extrémité 5' de la sonde est inhibé par quencher à l'extrémité 3' : sondes libres en solutions ne sont pas fluo Taq polymérase libère le reporteur à chaque hybridation sonde+ADN complémentaire du patient. Reporteur libre = fluo visible Réduit l'émission de fluo non-spécifique par mauvais appariement Niveau de fluo proportionnel aux bonnes hybridation. Si le seuil attendu est atteint plus lentement que la normale, ça veut dire qu'il y avait moins d'ADN initialement aka délétion.

Answer 19

si patient A reach le seuil de fluorescence établit préalablement après 24 cycles et patient B le reach après 25 cycles, on peut penser que patient B avait 2x moins d'ADN au départ (pcq ADN double à chaque cycle et lui il a n+1 p/r a patient A). on suppose donc une délétion

Answer 20

dél/dup dans plusieurs régions d'un gène: spot les copies d'une même séquence dans un gène 1. 2 sonde en ss-unités qui s'assemblent sur ADN patient et liées par ligase 2. amplification PCR sonde+ADN 3. électrophorèse sur le diagramme de résultat, on voit la quantité de chaque exon comparé à un contrôle

Answer 21

COMPARTIMENTS => multiplie l'info obtenue en analyse => analyse ++ gènes de ++ patients en mm temps analyse bioinformatique: 1. ++ séquences de 100-150 pb attitré à chaque patient avec code-barre moléculaire 2. alignement séquences dans le génome (cette séq appartient à quel gène) 3. identifier si variations de ces séquences ont déjà été discutées 4. variations patho? est-ce qu'il sont dans des gènes qui pourrait expliquer le phénotype du patient?

Answer 22

grâce aux code-barre unique à la séquence de chaque patient

Answer 23

pcr se fait dans des micelles d'huile 1 bulle = 1 rxn d'un gène pour 1 patient on brise l'émulsion aka les bulles pour mettre le produit dans des plaques à puits pour séquencer

Answer 24

comme pcr-émulsion, c'est une amplification en parallèle mais ici les séquences ADN sont fixées sur une plaque "flow cell"

Answer 25

pcr-émulsion & pcr-cluster : ++ gènes de ++ patients amplifiés en même temps