Klonierungsstrategien

Question 1

Definition: Klone

Answer 1

genetisch veränderte Nachkommen
Aggregate/Kulturen identischer Zellen
Pflanzen/Tiere mit identischen Genen

Question 2

Prinzip d. Gen-Klonierung

Answer 2

1. Präparation GOI
2. Präparation d. Vektors
3. Rekombinieren v. Vektor & GOI
4. Vermehren rekombinanter DNA
5. Selektion auf Transformanden
6. Identifizierung
7. Charakterisierung, Sequenzierung, etc.

Question 3

GOI-Präparation: Wie?

Answer 3

PCR
reverse Transkription
enzymatische Restriktion
Modifizierung

Question 4

Vektor-Präparation: Wie?

Answer 4

enzymatische Restriktion
Modifizierungen
TA-Klonierung

Question 5

Rekombinieren: Wie?

Answer 5

Ligase
Topoisomerase
PCR
Gateway-Techniken

Question 6

Vermehren: Wie?

Answer 6

Infektion/Transfektion v. Wirtszellen (GVOs)

Question 7

Identifizierung: Wie?

Answer 7

rekombinanter Vektor

Question 8

Anwendungen für Klonierung

Answer 8

Subklonierung (Sequenzanalyse)
Genbänke: vollständig, partiell, (c)DNA
Proteinexpression (Funktionsanalyse)
Mutagenese-Experimente
Knock-in/-out/-down-Konstrukte
Gentherapie
gen. veränderte Planzen/Tiere

Question 9

Plasmid-Vektoren: MSC, Restriktionsenzyme, ORI, Selektionsmarker, Backbone?

Answer 9

Multiple Cloning Site: Schnittstellen für Restriktionsenzyme
Restriktionsenzyme: verschiedene Schnittmöglichkeiten
ORI: spezifisch für Organismus, muss erhalten bleiben, manchmal 2 ORI wenn in Prokaryont gearbeitet wird
Selektionsmarker: erlaubt Selektion transferierter Bakterien, Antibiotika-Resistenz
Backbone: abgeleitet v. Bakterienplasmid

Question 10

Definition: Copy-Number, Klonierungskapazität

Answer 10

Copy-Number: wie gut ist Vektor zu replizieren

Klonierungskapazität: wie viel DNA ist effizient zu Transferieren (bei kleinem Vektor besser)

Question 11

Verscheidene Plasmid-Vektoren

Answer 11

F-Plasmid: bakteriell
T-Plasmid: bakteriell, tumor-induzierend
Lambda-Phage: dsDNA, linear
Einzelstrangphage: ssDNA
Viren-Derivat
Hefe-Vektoren: lange DNA-Stücke, YACs

Question 12

Plasmide für (Sub)Klonierung v. (c)DNA

Answer 12

pUC-Plasmid-Familie, pTOPO-Vektoren

Question 13

Plasmide für Proteinexpression & -reinigung

Answer 13

pET-Plasmide (His-Tag-Reinigung), pGEX-Plasmide (GST-Pulldowns)

Question 14

Welche Sequenzen haben Vektoren für Fusionsproteine?

Answer 14

Tag/Linker-Sequenz & Protein-Sequenz

Question 15

Verschiedene Tags und welche Purifikation möglich ist

Answer 15

His-Tag: Säulenchromatografie
Epitop-Tags: Immunaffinitäts-Chromatografie
GST-Tag: Affinitätschromatografie
HA-Tag: nicht-chromatografische Methoden
GFP-Tag/Compund-Tag: Detektion

Question 16

Was ist FLAG-Tag?

Answer 16

Phagen-Peptid aus AS: 1DYKDDDDK8 -> Erkennung durch Ak

Question 17

Prinzip d. GST-Pulldowns

Answer 17

1. Suspension aus Glutathion-Sepharose waschen & equilibrieren
2. Zugabe d. Proteinlösung aus Bakterienlyse
3. Proteine mit GST-Tag binden covalent an Sepharose -> Waschen
4. Zugabe d. zu analysierenden Proteinlösung
5. Protein bindet an GST-Protein -> Waschen
6. Ablösen d. Protrin-Protein-GST-Komplexe: pH-Änderung, Glutathion-Inkubation, etc.
7. Trennen d. Komplexes: Hitzedenaturierung, Separieren: SDS-PAGE, Analyse: Western Blot

Question 18

Phagen-Vektoren: Wo Fremd-DNA? Verpackung? Genbänke?

Answer 18

Fremd-DNA in zentralem Teil ohne Vermehrungsverlust
Verpackung: in Phagen, in-vitro-Packaging
Genbänke möglich

Question 19

Cosmide: Besonderheiten? Packaging? Genbänke?

Answer 19

Plasmid-Elemente mit COS-Sites
rekombinante Klone sind Bakterien -> keine neuen Phagen
Packaging: in Phagen, in-vitro-Packaging
Genbänke möglich

Question 20

COS-Site: Funktion?

Answer 20

12 NT, GC-reich
3’ & 5’-Ende v. Phagen-DNA: Sticky Ends
bei Packen: Portal-Protein erkennt COS-Sites -> COS bis COS, dann Schnitt
bei zu wenig DNA -> Phage instabil

Question 21

Bevorzugung lytischer Weg: Wie?

Answer 21

Gene für lysogenen Weg werden mit Target-Genen ersetzt

Question 22

Imitieren v. DNA-Concatameren die bei Rolling-Circle-Replikation entstehen?

Answer 22

Annealing d. COS-Sites in vitro

Question 23

Yeast Artificial Chromosome: Was? Packen? Stabilität?

Answer 23

artifizielles Chromosom: Telomer- & Centromer-Region
Packung: Einschläußen in Tochterzelle während Mitose
Kleine/Keine Inserts -> instabiles YAC, fällt v. Spindelapparat

Question 24

Replikationsdefiziente Viren zum Einschleußen v. Fremd-DNA: Produktion? Infektion? DNA-Integration?

Answer 24

Produktion: in HEK293T-Zellen, Transfektion v. DNA & Verpackungs-Plasmiden
Infektion: ja, aber keine Gene für Kapsidproteine, Glycoproteine, Vermehrungs-Faktoren
Integration: dsDNA kan inn Wirts-cDNA integriert werden

Question 25

3 Plasmide für replikationsdefiziente Viren & was codiert?

Answer 25

Transfer-Vektor: cDNA/shRNA, LTR Packaging-Vektor: GAG, Pol, TAT Envelope-Vektor: ENV

Question 26

Faktoren für Vektor-Auswahl

Answer 26

``` Größe d. Inserts Größe d. Vektors Restriktionsstellen Anzahl an Kopien Klonierungseffizienz Screening-Fähigkeit ```

Question 27

Restriktionsenzyme: Welche Enzyme? Erkennungsstelle? Überhänge? Variabilität?

Answer 27

meist bakterielle Restriktionsendonukleasen Erkennungsstelle = Schnittstelle Überhänge: Sticky oder Blunt Ends, Vektor & Target mit gleichem Enzym -> passend Variabilität: Isoschizomere, Neoschizomere, Isocaudomere

Question 28

8-Base-Cutter: Name & Sequenz

Answer 28

Not I: GC|GGCC|GC (Sticky Ends)

Question 29

6-Base-Cutter: Name & Sequenz

Answer 29

Bam HI: G|GATC|C (Sticky Ends) Bgl II: A|GATC|T (Sticky Ends) Stu I: AGG|CCT (Blunt Ends) Kpn I: GGTAC|C (Blunt Ends)

Question 30

4-Base-Cutter: Name & Sequenz

Answer 30

Alu I: AG|CT (Blunt Ends) | Sau 3a/Mbol: |GATC| (Sticky Ends)

Question 31

cDNA-Klonierung: Ablauf

Answer 31

1. Restriktion d. Plasmid-/Phagenvektors 2. Isolierung & Reinigung v. mRNA 3. Reverse Transkriptase: cDNA aus mRNA 4. Ligation v. cDNA & Vektor 5. Transfektion/Transduktion d. Wirtsorganismen 6. Wachstum unter Selektionsbedingungen 7. Identifizierung & Vermehren v. Rakombinanten 8. Analyse

Question 32

Reverse Transkriptase: welche Enzyme in Komplex?

Answer 32

Stammt aus Retroviren | RNA-abhängige DNA-Pol, DNA-abhängige DNA-Pol, RNase H, Integrase

Question 33

TA-Cloning (TOPO-TA): Funktionsweise?

Answer 33

Taq-Pol: 1NT Adenin-Rest an PCR-Produkt TOPO-Vektoren: 1NT Thymin-Rest Überhang, kovalent gebundene Topoisomerase an 3' & 5'-Ende schwache Assoziation GOI & TOPO-Vektor -> kovalente Verknüpfung über Topoisomerase

Question 34

Selektion auf Transformanden vs. auf GOI?

Answer 34

Wachsen d. bakterien auf Selektionsmedium: Selektion auf enthaltenen Vektor Replica-Plating: Übertragen via Stempel auf 2. Selektionsmedium: Selektion auf GOI

Question 35

Selektionsmedien & Art d. Selektion

Answer 35

Antibiotika-Medium: Einfach- & Doppelselektion LacZ-Expression: Blau-Weiß-Selektion lethale Gene: bei eukaryontischen Systemen Mangel-Medium: bei Hefen Herbizide: Pflanzentechnologie

Question 36

PCR-Screening: Funktionsweise?

Answer 36

1. Picken d. Bakterien (Zahnstocher) v. Master-Plate 2. Zahnstocher in PCR-Mix tauchen 3. Zahstocher in Kulturröhrchen mit Medium 4. PCR & Produktanalyse auf Agarosegel 5. Parallel Kulturröhrchen mit Medium inkubieren 6. Isolierung d. Plasmide über Minipräp

Question 37

Vektoren für Genbänke

Answer 37

Lambda-Phagen: Lambda-gt für Insertion, Lambda-EMBL für Replacement Cosmide YAC BAC