Labo 4 - Isolation et quantification des bactériophages

Question 1

Quelles sont les étapes globales du laboratoire bactériophages?

Answer 1

1- Amplification des phages (fait par le technicien)
2- Centrifugation et filtration des phages amplifiés
3- isolation et quantification des phages amplifiés
4-Évaluation de la spécificité des phages amplifiés
5- Dénombrement des phages

Question 2

Expliquez le but général de l’amplification

Answer 2

Afin d’obtenir un grand nombre de phages spécifiques à la bactérie E.coli immobile, le mélange de phages d’eaux d’égout doit être incubé en présence de la bactérie pour être amplifié, et ce, avant d’être isolé. Le rôle de l’amplification est la multiplication et l’augmentation de la concentration des phages qui se trouvent dans l’eau d’égoût.

Question 3

Expliquez le but général de la centrifugation

Answer 3

La centrifugation nous permet d’éliminer les diverses débris, les bactéries et leurs fragments pour purifier la solution de phages amplifiés.

Question 4

Expliquez le but général de la préparation gélose molle

Answer 4

Lors de l’ensemencement des phages sur la glose, il est plus facile de verser une gélose molle sur l’échantillon que d’étendre la solution avec une tige d’étalement . La dispersion des phages et des bactéries est optimale et ceci améliore le décompte et la prise de résultats.

Question 5

Expliquez le but général de la dilution en série de la solution de phages amplifiés

Answer 5

Ces dilutions permettent de diminuer le nombre d’unités de Phage sur la glose afin d’être capable de voir les plages de lyse et surtout de les dénombrer sur la gélose.

Question 6

Expliquez le but général de l’évaluation de l’ensemencement des gloses avec le mélange phages-bactéries

Answer 6

Afin de déterminer visuellement la présence des phages, le mélange phases-bactéries est ensemencé sur une glose solide et ensuite étalé à l’aide d’un petit volume de glose molle sur le dessus

Question 7

Expliquez le but général de la filtration

Answer 7

La filtration nous permet d’obtenir une solution de Phage dont la pureté est optimisée. La filtration du surnageant avec un filtre muni de pores très fins (0,20um à 0,45um) va bloquer le passage des plus petites bactéries, mais non des phages.

Question 8

Expliquez l’interprétation du dénombrement des phages en fonction des plages de lyse

Answer 8

Après incubation, si le phage a été mis en présence de bactéries spécifiques, des zones claires appelées “plages de lyse”, devraient être observées sur le tapis bactérien. Ces plages de lyse correspondent à des endroits où le virus s’est multiplié et a lyse (éclaté/tué) la ba série, empêchant ainsi sa multiplication et donc sa présence à l’oeil nu sur la glose. Une plage de lyse équivaut à une “unité de phage formant une plage de lyse”. Le nombre de plages de lyse observées sert à évaluer la concentration de phages dans l’échantillon de départ. Plus la solution est diluée, moins il y a de phages déposés sur la gélose.

Question 9

Quelles sont toutes les étapes de la partie 1 (globalement, ne pas connaître les quantités)

Answer 9

1. Dans un microbe de 1,5 ml, Pipeter:
   - 10 ul de phages
   - 1 ml de bouillon nutritif
   - 100 ul d’une culture de E.coli immobile
2. Incuber le microtube 24 heures à 37 degré Celsius
3. Garder le microtube à 4 degré Celcius jusqu’à la prochaine étape du protocole

Question 10

Quelles sont toutes les étapes de la partie 2 (globalement, ne pas connaître les quantités)

Answer 10

Élimination des résidus par centrifugation;

4. Centrifugation du microtube
5. Balancer la centrifugeuse avec un microtube d’eau
6. Centrifuger à 2500 rpm pendant 10 minutes

Purification des phages amplifiés par la filtration;

7. Aspirer 1 ul de surnageant avec la seringue
8. Visser le filtre 0,22 um et filtrer la solution dans un nouveau microtube stérile (il est important de pousser doucement sans forcer sur la seringue)

Question 11

Quelles sont toutes les étapes de la partie 3 (globalement, ne pas connaitre les quantités)

Answer 11

Préparation de la gélose molle;

9. Placer 4 ou 8 tubes de gloses nutritives (LB) au bain-marie ou dans un bécher d’eau bouillante sur une plaque chauffante pour les liquéfier (un tube pour chaque ensemencement prévu)
10. Une fois les gloses liquéfiées, maintenir la température des tubes entre 50 degré et 55 degré dans un bain thermostaté

Dilutions en série de la solution de phages amplifiés;

11. Identifier 5 tubes stériles en vitre avec bouchon selon les dilutions (10-2 à 10-7)
12. À l’aide d’une pipette de 10 ml, Pieter, 9,9 ml de saline stérile dans le tube 10-2 et 10-4
13. À l’aide de la même pipette, pipeter 9,0 ml de saline dans les autres tubes
14. À l’aide d’une micropipette (P100) ajouter 100 ul de la solution de phages filtrés au tube 10-2
15. Boucher le tube et vortexer
16. Transférer 100 ul (avec micropipette P1000) du tube #1 au tube #2
17. Boucher. Agiter au vortex
18. Transférer 1000 ul (avec micropipette P1000) du tube #2 au tube #3
19. Boucher. Agiter au Vortex
20. Répéter les étapes 18 à 19 en complétant la dilution en série jusqu’au dernier tube

Solution du mélange phages-E.coli immobile;

21. Identifier 4 microtubes en notant la dilution des phages (10-4 à 10-7) et le type de bactérie testée E.coli immobile
22. Dans chaque microtube, pipeter 50 ul de la solution diluée de phages correspondante
23. Ensuite, pipeter 250 ul de la culture de E.coli immobile dans chacun des microtubes
24. Mélanger les microtubes au vortex

Ensemencement des gloses avec le mélange phares-bactéries E.coli immobiles par la méthode d’incrustation agir-mou;

25. Identifier 4 vases de pétri selon les dilution testées (10-4 à 10-7), le type de bactérie testé (E.coli immobile) et les initiales des manipulateurs. Annotation sur le fond du pétri et non sur le couvercle
26. Faire une gélose à la fois… Pour chaque gélose, faire l’ensemencement suivant;
    a) Retirer un tube de gélose molle du bain chauffant
    b) Mélanger le microtube au vortex
    c) Pipetter 100 ul de la solution “phages-bactéries” dans le tube de gélose molle et agiter le fond du tube avec les doigts (petite pichenotte)
    d) Sans attendre, verser entièrement le tube de gélose dans le vase de pétri (ne pas laisser de petites gouttes) et agiter la pétri par rotation tout en la dispersant immédiatement la gélose molle sur toute la surface
    e) Bien laisser durcir les gloses
27. Recommencer l’étape 26 pour chacun des 4 microtubes
28. Mettre un ruban de parafilm autour des gloses
29. Incuber les gloses à 37 degré Celsius pendant 24 heures

Question 12

Quelle sont les utilités (4) des bactéries

Answer 12

1) Amplification des phages (multiplication des phages)
2) Vérification de la spécificité des phages
3) Obtention de plages de lyse (important pour décompte)
4) Phage survit en présence d’une bactérie hôte, ce qui rend la bactérie nécessaire à la multiplication des phages

Question 13

Quel est l’utilité de l’Eau d’égout

Answer 13

Source de phages importante en raison de la présence de nombreuse bactéries

Question 14

Quelle est l’utilité de l’incubateur

Answer 14

Favoriser la croissance bactérienne optimale dans des conditions de 37 degré Celsius (température du corps)… conditions in vivo

Question 15

Quelle est l’utilité du brûleur

Answer 15

Pour travailler en asepsie la chaleur empêche la contamination bactérienne)

Question 16

Quelle est l’utilité du milieu nutritif solide ou liquide

Answer 16

Donner les nutriments nécessaires à la croissance bactérienne

Question 17

Quelles sont toutes les étapes de la partie 4 (globalement, ne pas connaitre les quantités)

Answer 17

Solution de phages-E. coli mobile;

30. Identifier 4 microtubes en notant la dilution des phages (-4 à -7). Ne pas oublier de mentionner le type de bactéries
31. Dans chaque microtube, pipeter 50ul de la solution diluée de phages qui correspond (travailler en asepsie)
32. Pipeter 250ul de la culture de bactéries dans chaque microtube
33. Mélanger les microtubes à l’aide du vortex

Ensemencement des géloses avec le mélange phages-bactéries (dans ce cas, E. Coli mobile) par la méthode d’incrustation agar-mou;

34. Identifier 4 vases de pétris selon les dilutions testées (-4 à -7), le type de bactéries testé et les initiales. Tout sur les fond.
35. UNE GÉLOSE À LA FOIS.

A) Retirer un tube de gélose molle du bain chauffant
B) Mélanger le microtube au vortex
C) Pipetter 100ul de la solution «phages-bactéries» dans le tube de gélose molle et agiter le fond du tube avec les doigts (petite pichenotte)
D) Sans attendre, verser l’entièreté du tube de gélose dans le vase de pétri par rotation tout en la dispersant immédiatement la gélose molle sur toute la surface

36. Recommencer l’étape 35 pour chacun des 4 tubes
37. Mettre un ruban de parrafilm autour des géloses
38. Incuber les géloses à 37 pendant 24h

Question 18

Dans la situation réelle d’une bactérie multirésistante, quelles sont les étapes à faire avant l’amplification des phages?

Answer 18

Il faudrait récolter la bactérie à partir de son milieu (ex. entérique, sur la peau, la gorge). Il faut également recueillir un échantillon de phages d’une source où la bactérie a pu se propager, par exemple les eaux usées.

Question 19

Dans la situation réelle d’une bactérie multirésistante, quelles sont les étapes à faire après le dénombrement des phages? (globalement)

Answer 19

Isolation des plages de lyse sur la gélose;

1. Identifier un microtube”PDL”
2. Isoler une plage de lyse si le ratio de phages/bactéries le permet en découpant la circonférence de la plage de lyse avec un mini-scalpel
3. Retirer la plage de lyse à l’aide du bout du scalpel
4. Déposer la plage de lyse dans le microtube identifié et ajouter 1ml d’eau saline stérile
5. Agiter au vortex jusqu’à une séparation complète des constituants de la gélose

Centrifugation/filtration/purification des plages de lyse contenant les phages;

6. Utiliser la centrifugeuse à basse vitesse pour séparer les constituants du microtube contenant la plage de lyse. Centrifuger pendant quelques minutes.
7. Récolter la suspension du mélange (qui comprend les phages) à l’aide de la micropipette (P1000) pour l’ajouter dans un nouveau microtube bien identifié.
8. Ajouter 100 ul d’eau saline à l’aide de la micropipette (P1000) dans le microtube contenant le mélange de phages
9. effectuer de nouveau la centrifugation pour permettre une meilleur séparation des phages et de la gélose
10. aspirer le mélange à l’aide de la seringue de 1ml
11. Utiliser un filtre de 0,22 um pour filtrer le mélange de phages en l’apposant sur la seringue
12. Pousser sur le piston pour filtrer la solution et la récupérer dans un microtube identifié.
13. Ajouter avec la micropipette un petit volume de chloroforme dilué à la solution contenue dans le microtube, et ce, sous la hotte
14. Refaire les étapes 9 à 12 pour permettre une meilleure filtration des phages

Question 20

Pourquoi vortexer?

Answer 20

Vortexer permet l’homogénéisation ainsi que la dilution de la substance qui vient d’être ajoutée dans la substance qui était déjà dans le tube

Question 21

Expliquez l’utilité de la seringue dans le laboratoire et justifiez à l’aide d’une différence avec la bactérie et le virus

Answer 21

La seringue permet d’injecter le surnageant dans un nouveau microtube à l’aide du filtre 0,22 um. Cette technique est pratique dans la mesure où le virus est de l’ordre de grandeur nm tandis que la bactérie est de l’ordre um. De ce fait, les bactéries resteront dans le filtre alors que les phages se ramasseront dans le microtube.

Question 22

Quelle est l’utilité du chloroforme

Answer 22

Tuer les bactéries, permet d’isoler les phages dans le mélange péages-bactéries puisque bactéries mortes