Laboratoires Flashcards
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Transformation bactérienne
C’est une technique qui permet d’introduire de l’ADN exogène, comme un plasmide, dans une bactérie afin de modifier son patrimoine génétique. Cela permet notamment de lui conférer des propriétés nouvelles, comme la résistance à un antibiotique ou la capacité à produire une protéine spécifique.
Bactérie compétente
Les bactéries deviennent compétentes après un traitement chimique (par ex. CaCl₂), ce qui rend leur membrane cellulaire plus perméable à l’ADN. Cela permet au plasmide d’entrer plus facilement lors de la transformation.
Rôle du choc thermique
Le choc thermique crée un stress soudain qui provoque une réorganisation transitoire de la membrane plasmique, permettant au plasmide de pénétrer dans la cellule bactérienne.
Pourquoi incuber après le choc thermique dans un milieu sans antibiotique?
Cette étape post-choc permet aux bactéries de réparer leurs membranes, d’exprimer le gène de résistance contenu sur le plasmide, et donc de survivre ensuite sur le milieu avec antibiotique.
Que se passe-t-il si on prolonge le choc thermique au-delà de 90 s ?
Un choc thermique trop long endommage irréversiblement la membrane cellulaire et peut tuer les bactéries avant qu’elles aient eu le temps d’intégrer ou d’exprimer le plasmide.
Quel est le rôle du plasmide dans une transformation ?
Le plasmide joue le rôle de vecteur. Il porte généralement un gène de sélection (comme AmpR) et le gène d’intérêt (ex. : une protéine à exprimer). Il permet à la bactérie de produire cette protéine ou de survivre dans un milieu sélectif.
But d’une minipréparation (miniprep)
La minipréparation est une méthode rapide et efficace pour isoler l’ADN plasmidique à partir d’une culture bactérienne. On utilise des tampons de lyse et des colonnes de silice pour purifier l’ADN circulaire.
Rôle du tampon P2
Le tampon P2 contient du SDS et de l’hydroxyde de sodium. Il détruit les membranes cellulaires et dénature l’ADN génomique et les protéines, facilitant l’extraction de l’ADN plasmidique.
Pourquoi ajouter N3 après P2 ?
Le tampon N3 est acide et neutralise l’alcalinité du P2. Il provoque la précipitation des débris cellulaires, des protéines et de l’ADN chromosomique. L’ADN plasmidique reste soluble.
Pourquoi utiliser une colonne de silice ?
La silice fixe sélectivement l’ADN en présence de sels chaotropiques. Les impuretés sont éliminées au lavage, puis l’ADN est élué dans un tampon ou de l’eau stérile.
Utilité de plusieurs digestions enzymatiques
Différentes enzymes coupent à des sites spécifiques. Comparer les profils de fragments permet de confirmer l’identité, la taille et l’intégrité du plasmide extrait.
Principe de l’électrophorèse sur gel
L’ADN est chargé négativement. Lorsqu’il est placé dans un champ électrique, il migre vers la borne positive à travers un gel d’agarose. Ce gel agit comme un tamis, séparant les fragments d’ADN selon leur taille : les petits fragments migrent plus loin que les grands.
Pourquoi l’ADN migre-t-il vers la borne + ?
Chaque molécule d’ADN porte des groupements phosphate qui sont négativement chargés. En électrophorèse, ces charges font migrer l’ADN vers l’anode (borne +) sous l’effet du courant électrique.
Que permet de vérifier la digestion enzymatique sur gel ?
En analysant les bandes obtenues sur gel après digestion enzymatique, on peut confirmer que le plasmide a la bonne taille, qu’il a été bien digéré et qu’il possède la conformation attendue (linéaire, superenroulée, etc.).
Différence entre superenroulé et linéaire sur gel
L’ADN superenroulé est plus compact et traverse plus facilement le gel, donc il migre plus rapidement. L’ADN linéaire est plus relâché et migre à une vitesse intermédiaire, tandis que l’ADN relâché circule plus lentement.
Rôle du ladder dans un gel
Le ladder est un mélange de fragments d’ADN de tailles connues. Il sert de référence pour déterminer la taille des fragments expérimentaux en comparant leur distance de migration.
But de l’induction par IPTG
L’IPTG est un inducteur chimique qui se lie au répresseur lacI, le désactivant. Cela libère le promoteur tac et permet l’expression du gène situé en aval, codant souvent une protéine recombinante comme GST-fusion.
Rôle du lysozyme dans la lyse cellulaire
Le lysozyme coupe les liens glycosidiques du peptidoglycane, composant principal de la paroi des bactéries Gram-, facilitant leur lyse mécanique ou chimique.
Rôle du Triton X-100
Triton X-100 est un détergent non ionique qui interagit avec les lipides de la membrane plasmique, entraînant sa rupture douce tout en conservant l’activité des protéines.
Pourquoi manipuler sur glace pendant l’extraction ?
La glace ralentit les réactions enzymatiques et évite la dénaturation thermique des protéines lors de la lyse ou de la sonication, garantissant une meilleure récupération.
Pourquoi conserver le surnageant après centrifugation ?
Après centrifugation, le surnageant contient les protéines libérées des cellules, y compris la protéine d’intérêt, tandis que les débris insolubles restent dans le culot.
Principe de la chromatographie d’affinité
La chromatographie d’affinité exploite l’affinité entre une étiquette de fusion (ex. GST) et un ligand (glutathion) fixé sur une matrice solide. Cela permet d’isoler spécifiquement la protéine cible.
Pourquoi utilise-t-on une étiquette GST ?
L’étiquette GST permet à la protéine recombinante de se fixer à une résine contenant du glutathion, rendant la purification spécifique, rapide et efficace.
Différence entre phase de lavage et d’élution
Le lavage retire les contaminants sans affinité, tandis que l’élution libère la protéine liée en ajoutant du glutathion libre en solution, qui entre en compétition avec la résine.
