Méthodes spectroscopiques optiques - Absorbance

Question 1

Qu’évaluent les méthodes spectroscopiques ?

Answer 1

Les interactions avec la lumière (ex: absorption, émission, réémission (fluorescence), chimiluminescence…).

Question 2

Vrai ou faux. Les méthodes spectroscopiques impliquent des techniques non destructives et très lentes.

Answer 2

Faux. Les méthodes spectroscopiques impliquent des techniques non destructives et très RAPIDES.

Question 3

Quel intervalle de longueurs d’ondes implique la lumière visible?

Answer 3

400 à 800nm

Question 4

Quel intervalle de longueurs d’ondes implique les UV?

Answer 4

190 à 400 nm

Question 5

Comment se nomme le diagramme des énergies qui montre les niveaux d’énergies vibrationnels dans les transitions des électrons?

Answer 5

Diagramme de Jablonski

Question 6

Vrai ou faux. Plus la longueur d’onde d’un photon est petite, plus plus il y a excitation forte et l’e- d’un atome passe d’une orbitale à un autre plus loin (à un niveau vibrationnel plus élevé).

Answer 6

Vrai.

Question 7

En fonction de quel variable peut-on mesurer quantitativement des propriétés d’absorption (ou transmission) d’un échantillon?

Answer 7

Mesure quantitative des propriétés d’absorption (ou
transmission) d’un échantillon en fonction de la longueur
d’onde (soit par l’intensité de la lumière incidente Io (lambda) et l’intensité de la lumière transmise I (lambda).

Question 8

Dans quel situation peut-il y avoir absorption de photon?

Answer 8

Il faut une molécule avec un chromophore.

Question 9

Qu’est-ce qu’un chromophore?

Answer 9

Un atome ou un groupe d’atomes d’une molécule qui est responsable de l’absorption de la lumière.
Ex : -C=O, -N=C=O, système conjugué…

Question 10

En l’absence de chromophore sur l’analyte, que peut-on faire pour permettre l’absorption de photon par une molécule?

Answer 10

On fait une réaction de dérivatisation : soit un attache un chromophore sur l’analyte en question par une réaction chimique.

Question 11

Qu’est-ce que la transmission (T)?

Answer 11

Perte de l’intensité (puissance) de la radiation qui traverse un échantillon.

Question 12

Qu’est-ce que l’absorption (A)?

Answer 12

Gain d’énergie de la molécule par l’interaction d’un photon avec celle-ci.

Question 13

Qu’est-ce que l’émission?

Answer 13

Gain d’énergie de la molécule par l’interaction d’un photon avec celle-ci.

Question 14

Qu’est-ce que la réémission (fluorescence (F) ou phosphorescence)?

Answer 14

Absorption de la radiation suivie d’une perte partielle de l’énergie absorbée et d’une réémission de la radiation électromagnétique.

Question 15

Qu’est-ce que la chimiluminescence?

Answer 15

Augmentation de l’énergie d’une molécule grâce à une réaction chimique, suivie de la production ou radiation d’un photon.

Question 16

Qu’est-ce que la diffusion?

Answer 16

Interaction de la radiation avec la matière sans changement ou avec changement de longueur d’onde. La diffusion implique habituellement un changement de direction du photon.

Question 17

Qu’est-ce que la diffraction?

Answer 17

Comportement des ondes lorsqu’elles rencontrent un obstacle (un point) ou une ouverture. C’est le résultat de l’interférence des ondes diffusées par chaque point. Les monochromateurs sont basés sur un réseau de diffraction.

Question 18

Dans une protéine, le lien peptidique est un chromophore faible ou fort?

Answer 18

Chromophore faible avec une longueur d’onde max d’environ 195nm (pour lien -CO-NH-).

Question 19

Donner le chemin que parcours une source lumineuse jusqu’à le traitement des données pour mesurer l’absorption.

Answer 19

1- Source lumineuse externe (ex : lampe de Deutérium).

2- Ondes lumineuses passent dans un monochromateur.

3- Cellule d’absorption (ex : échantillon = analyte + matrice).

4- Photo-détecteur: Fait différentiation entre intensité de la lumière incidente et l’intensité de la lumière transmise.

5- Traitement des données (amplification et affichage).

Question 20

Entre quelles étapes de la définition de l’absorption lumineuse peut-on déduire l’intensité lumineuse incidente?

Answer 20

Entre le monochromateur et la cellule d’absorption.

Question 21

Entre quelles étapes de la définition de l’absorption lumineuse peut-on déduire l’intensité lumineuse transmise?

Answer 21

Entre la cellule d’absorption et le photo-détecteur.

Question 22

Qu’est-ce que la loi de Beer-Lambert?

Answer 22

Cette loi donne le lien quantitatif entre la substance qui absorbe la radiation et la quantité de radiation absorbée. La loi permet de construire une courbe d’étalonnage pour un standard (x) afin d’effectuer une quantification subséquente sur une solution inconnue qui contient (x).

Question 23

Quel est l’effet du pH sur l’absorptivité molaire d’un acide aminé?

Answer 23

En changeant le pH, les niveaux énergétiques ont changé, la longueur d’onde pour absorbance a changé.
Augmentation du pH → ↑ de la longueur d’ondes → ↓ énergie nécessaire au changement d’un électron d’un orbitale à l’autre (ou d’un niveau vibrationnel à un autre).

Question 24

Dans le spectre d’absorption de l’albumine de sérum bovin (BSA), où retrouve-t-on les bandes d’absorption maximale d’une protéine modèle :

A) Moins intense
B) Plus intense

Answer 24

A) Moins intense : 280 nm

B) Plus intense : Entre 190 et 210 nm

Question 25

Dans les acides aminés aromatiques, à quelle bande d'absorption il y a induction de transitions de n→pi*?

Answer 25

Bande à 280nm.

Question 26

Dans les groupements amides (liens peptidiques), à quelle bande d'absorption il y a induction de transitions de pi→pi*?

Answer 26

Bande à 200nm.

Question 27

Pourquoi la quantification des protéines dans un mélange complexe par l'absorption UV-vis est difficile?

Answer 27

Puisque la composition des protéines et de leur coefficient d'absorption ne sont pas toujours connus.

Question 28

Pour déterminer la concentration totale de protéines dans un mélange complexe par spectrophotométrie d’absorption, des méthodes colorimétriques sont souvent employées. Sur quoi se basent ces méthodes?

Answer 28

Ces méthodes sont basées sur la réaction d’agents chromophores avec les liens peptidiques ou avec certains acides aminés des protéines.

Question 29

Vrai ou faux? La réaction d’agents chromophores avec les liens peptidiques donne lieu à une coloration (dans la région visible) dont l’intensité (l’absorbance) est directement proportionnelle à la concentration de la protéine.

Answer 29

Vrai.

Question 30

Quel est le principe de la méthode de Biuret?

Answer 30

Les ions Cu2+ (ajoutés sous forme de sulfate de cuivre) se lient aux atomes d’azote des liens peptidiques de la protéine dans des conditions de pH alcalin, produisant ainsi un complexe de couleur mauve avec absorption maximale à 540-550 nm.

Question 31

Quel est le temps d'attente nécessaire pour le développement de la couleur dans la méthode de Biuret?

Answer 31

Un temps d’attente d’environ 30 min est nécessaire pour le développement de la couleur.

Question 32

Quel est le principe de la méthode de Lowry?

Answer 32

Cette méthode couple les réactions impliquées dans la méthode de Biuret avec une 2e réaction rédox (couleur). Ex : 1. Complexation d’ions Cu2+avec les atomes d’azote des liens peptidiques de la protéine dans des conditions de pH alcalin. Le Cu2+est ainsi réduit au Cu+. 2. Les ions Cu+et les radicaux du Trp, Tyr et Cysréduisent le complexe acide phosphotungstique / acide phosphomolybdique (couleur jaune) contenu dans le réactif Folin-Ciocalteau (Na2MoO4+ Na2WO4+ H3PO4), produisant ainsi une couleur bleue.

Question 33

Quelle est la différence entre la méthode de Biuret et de Lowry?

Answer 33

La méthode de Lowry est plus poussée et permet d'atteindre des absorptions plus petites et plus précis (plus sensible).

Question 34

Avec la méthode de Lowry : A) Quelle absorbance peut être mesurée? B) Le temps d'attente nécessaire pour le développement de la couleur?

Answer 34

Avec la méthode de Lowry: A) L’absorbance peut être mesurée soit à 540 nm ou à 720 nm. B) Un temps d’attente d’environ 40 min est nécessaire pour le développement de la couleur.

Question 35

Quel est le principe de la méthode de Bradford?

Answer 35

Un colorant, le Coomassie Brilliant Blue G-250, est ajouté à la solution de protéine dans des conditions de pH acide. Ex: Le Coomassiese lie à la protéine par des interactions non-covalentes (ponts hydrogène, interactions hydrophobes et interactions ioniques)et sa longueur d’absorption maximale augmente de 465 nm (solutionrouge) à 595 nm (solution bleue).

Question 36

Avec la méthode de Bradford : A) Quelle absorbance peut être mesurée? B) Le temps d'attente nécessaire pour le développement de la couleur?

Answer 36

Avec la méthode de Bradford : A) 465nm (solution rouge) à 595nm (solution bleue). B) Méthode simple et rapide (5 min), ajout d’un seul réactif.

Question 37

Pourquoi le spectre du blanc est important?

Answer 37

Parce que le blanc permet de faire une solution de référence vis à vis les autres spectres d'absorption. A≈log(Iblanc/Iéch.)

Question 38

Quelle est la longueur d'onde max de tous les nucléotides ?

Answer 38

La longueur d'onde max des nucléotides est autour de 260nm.

Question 39

Est-ce que la valeur de la longueur d'onde des nucléotides est affectée par le glucide et le phosphate dans le nucléotide?

Answer 39

Non.

Question 40

À longueur d'onde de 260nm, quelle est la transition des purines et pyrimidines des nucléotides?

Answer 40

Transitions pi→pi*.

Question 41

Qu'est-ce que le phénomène d'hypochromisme ou d'hypochromicité?

Answer 41

En général, les polynucléotides et les acides nucléiques absorbent moins que leurs constituants, les nucléotides. Ex: Le tétranucléotide AAAA exhibe une plus faible absorbance par nucléotide en solution aqueuse que l’adénine, l’adénosine et l’adénosine-5’-phosphate (individuel) : avec l'ajout du lien peptidique, il y a ajout d'un chromophore faible, donc il y a moins d'absorbance.

Question 42

Quelle est la formule de calcule : A) % d'hypochromicité? B) % d'hyperchromicité?

Answer 42

A) % hypochromicité = ((A mononucléotide - A tétranucléotide) / A mononucléotide) X 100 B) % hyperchromicité = ((A ADN dénaturé - A ADN natif) / A ADN natif) X 100

Question 43

Avec des échantillons d'ADN, comment peut-on savoir s'il y a présence de protéines ou d'ARN dans les échantillons? Sachant que : 1) L’absorbance à 260 nm peut être mesurée pour estimer la concentration d’acide nucléique en utilisant une valeur de epsilon260nm≈ 1x10^4 M-1 cm-1. 2) Les protéines sont des interférents. Il est donc indispensable de mesurer également l’absorption à 280 nm.

Answer 43

Pour les échantillons d'ADN pur : A260nm / A280nm = 1.8 Un rapport < 1.8 indique la présence de protéines, tandis qu’un rapport > 1,8 indique la présence d’ARN.