Metodi Di Analisi Flashcards
(9 cards)
Come possono essere fatte le analisi microbiche?
Le analisi microbiche posso essere scolte in due modi:
METODI COLTURALI = impiego di terreni per l’isolamento e la caratterizzazione di specifici gruppi microbici.
METODI MOLECOLARI = analisi di caratteri biochimici e genetici su singoli isolati o campioni complessi.
Come funzionano e quali sono i metodi colturali?
I metodi colturali sono metodi classici, prevedono:
A) arricchimento/selezione
B) isolamento di colture pure
C) caratterizzazione fenotipica degli isolati.
A) COLTURE DI ARRICCHIMENTO:
Condizioni colturali che favoriscono lo sviluppo del microorganismo desiderato e sfavoriscano gli altri, le colture selettive selezionano in modo specifico ed esclusivo il genere interessato.
- il terreno di coltura deve essere adatto alla crescita microbica (presenza/assenza di un nutriente, pH specifico, forza ionica, potenziale redox) e avere le giuste risorse (Giusta T, agitazione, an/aerobiosi, luce)
Le colture però hanno limiti, infatti l’organismo più adatto alle condizioni scelte prenderà il sopravvento sugli altri, non sempre Il microorganismo dominante e la quantità di inoculo è importante: campioni diluiti e non diluiti possono portare arricchimenti e risultati molto diversi.
PROCEDIMENTO: Innanzitutto dopo aver inoculato un campione viene seminato nel terreno di arricchimento o terreno selettivo in condizioni appropriate, dopo si isolano le singole colonie del microorganismo ricercato, una parte del brodo culturale sviluppato viene seminata su piastre agar dello stesso terreno per coltivarle.
La colonna di Winogradskij è un ecosistema microbico artificiale utilizzato come fonte durevole per inoculi fototrofi, chemiolitotrofi e anaerobi.
Viene preparato riempiendo per metà una colonna di fango ricco organicamente (preferibilmente solfitico) si aggiungono CaCO3 e CaSO4 al fango, si cerca di rimuovere tutta l’aria dal fango e poi si riempie la parte rimanente di acqua.
In genere si sviluppano diverse comunità di batteri, alghe e cianobatteri in alto della colonna (ossigenano la parte superficiale) i processi fermentativi nel fango portano alla riduzione del solfato e alla formazione di un gradiente che scatena sviluppo di batteri sulfurei.
B) ISOLAMENTO IN COLTURA PURA:
Contiene un solo tipo di microorganismo (coltura axenica) questo tipo di colture si ottengono attraverso striscio su piastra o diluizioni seriali (terreno solido, liquido o soft agar)
Nel tubo di agar disciolto per esempio una coltura è mischiata con segar sciolto, risultante in colonie incastrate e sigillate nell’agar = ottimo per microaerofilli o anaerobi.
Tecnica MPN (most probable number) è una tecnica usata per mirare un gruppo specifico, si fa usando un medium altamente selettivo, l’uso di vari tubi replicati ad ogni diluizione aiuta l’accuratezza dell’MPN finale.
Valutazione della purezza invece si fa osservando la morfologia con analisi microscopica cellulare, e verifica della crescita con terreni selettivi.
C) CARATTERIZZAZIONE FENOTIPICA DEGLI ISOLATI:
Con questa tecnica possono essere misurate le capacità di condurre reazioni (Cyt ossidasi per pseudomonas, catalani per staphylococcus, fermentazione ecc)
Oppure capacità di usare diverse fonti di C/N tramite API o BIOLOG/OMNILOG.
BIOLOG: una sospensione batterica è inoculata in micropiastre ed incubata dalle 18 alle 36 ore, si misura poi il tasso di crescita grazie ad una reazione calorimetrica. Questo approccio deve essere adattato e ottimizzato di volta in volta sulla base della matrice, i microorganismi coltivabili e isolabili sulla specifica matrice rappresentano solo una parte dell’intera comunità (esistono organismi VNC) le tecniche della biolog forniscono talvolta risultati incerti o di difficile interpretazione.
Cosa sono i metodi molecolari?
Sono metodi coltura-INDIPENDENTI che forniscono informazioni su struttura e funzioni delle comunità microbiche anche in mancanza di coltura di laboratorio, prevedono l’identificazione di un particolare microorganismo in un ecosistema complesso ed è possibile sia caratterizzazione qualitativa che quantitativa: qualitativa identificazione di gruppi microbici in un ecosistema, quantitativa quantificazione di microorganismi presenti.
Esistono due tipi di metodi: Microscopici e Genetici:
METODI MICROSCOPICI= danno informazioni quantitative, sono basati sull’impiego delle colorazioni: DAPI, arancio di acridina, SYBR green, sono numerosamente impiegati per quantificazione di microorganismi in campioni ambientali, però non distinguono cellule vive da cellule morte, penetrano in tutte.
L’unica colorazione che da informazioni anche sulla vitalità è SYTO9 assieme a Propidio ioduro, il primo penetra in tutte le cellule, il secondo solo nelle cellule morte dove la membrana non è più integra.
METODI GENETICI= danno informazioni sia qualitative che quantitative e permettono di esplorare la diversità genetica, si basano sulla ricerca di determinate sequenze geniche nel campione, sequenze ribosomiali e geni metabolici principalmente, vengono fatte attraverso tecniche di ibridazione e PCR.
Le sequenze ribosomiali sono le più utilizzate per studiare relazioni filogenetiche tra i diversi microorg. Infatti il GENE 16S rDNA è il più utilizzato nella ricostruzione della filogenesi, grazie alla sua lenta evoluzione, sono presenti regioni conservate fra tutte le specie batteriche, se le sequenze sono omologhe più del 97% i due ceppi analizzati appartengono alla stessa specie.
La regione 16S-23S di rDNA può contenere da 0 a 2 geni codificanti RNA, hanno un elevato grado di variabilità, utile per l’individuazione di sequenze specie e ceppo specifiche, il gene 23S è poco usato tassonomicamente però.
Geni Metabolici sono utili da analizzare perché possono essere scelti geni presenti unicamente in vie di uno specifico microorganismo o gruppo. Es: Nifh èil gene bersaglio= enzima della nitrogenasi viene codificato, i microorg. che hanno Nifh usano nitrogenasi in vie metaboliche con l’azoto.
Cosa sono le tecniche fish?
Fluorescent In Situ Hybridization sono tecniche dove si usano le sonde degli acidi nucleici ovvero gli oligonucleotidi di RNA e DNA complementari ad una determinata sequenza di geni bersaglio con colorazione fluorescente (utile per la filogenetica)
Il numero di sonde fluorescenti che si legano rispecchiano il numero di ribosomi, si possono individuare i diversi tipi di batteri e gruppi anche quando sono aggregati vicini.
Cos’è la PCR?
La PCR (Polymerase Chain Reaction) è un sistema di replicazione del DNA in vitro = permette di ottenere numerose copie di una specifica sequenza di DNA utili poi per esaminarle meglio.
Si usa la DNA polimerasi termostabile ed un primer di DNA come innesco per la duplicazione.
La PCR viene ripetuta circa 30/40 volte per avere abbastanza copie di DNA, i prodotti vengono poi separati sull’Agata gel per elettroforesi.
I target della PCR possono essere geni come i metabolici = vengono scelti geni unicamente presenti in vie metaboliche di uno specifico organismo
ES: usare primer specifici per il gene McrA per cercare metanogeni, l’amplificazione attesa è 837 bp, i campioni che arrivano a questo marker sono positivi per mcrA ovvero contengono geni per metanogenesi.
I geni 16S rRNA sono i più utilizzati per studiare le relazioni filogenetiche tra i microorganismi.
I primer specifici sono basati sulle sequenze ITS o 16S rRNA
I primer universali riconoscono sequenze conservate nel gene 16S
A cosa serve la corsa DDGE?
La corsa DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) serve per separare i frammenti amplificati in funzione della sequenza nucleotidica, che varia in funzione delle specie.
Per ogni campione saranno visualizzate più bande corrispondenti alle sequenze ribosomali delle specie dominanti nell’ecosistema microbico
Elettroforesi su gel di poliacrilammide con gradiente chimico di denaturazione: Urea e formammide.
Cos’è l’NGS?
Next Generation Sequencing indicano una serie di tecnologie che permettono di sequenziare grandi genomi in un tempo ristretto. Si ottengono quindi informazioni sul DNA dei microorganismi
L’impiego di queste tecniche permette, in un solo esperimento, di effettuare studi di vario genere tra i quali:
- caratterizzazione simultanea di genomi
- individuazione di riarrangiamenti cromosomici bilanciati e sbilanciati
- individuazione di delezioni e Copy Number Variations (CNV)
Le tecniche di NGS permettono di sequenziare:
DNA genomico, Intero genoma,
Esoma (solo la parte di DNA trascritto in RNA, esoni), Geni mirati, Ampliconi (solo prodotti PCR)
Trascrittoma:
RNA totale, mRNA
small RNA (<30 nt), Epigenoma
Metil-Seq , Sequenziamento bisolfito dell’intero genoma
Come si usa la metagenomica?
Metagenomica:
Sequenziamento degli interi genomi delle popolazioni microbiche di una comunità (spesso sequenze non complete, bozze)
-informazioni filogenetiche
-informazioni funzionali di un habitat
Non richiede informazioni preliminari sulle sequenze genetiche (diverso da primer PCR)
Metatrascrittomica: sequenziamento e analisi di tutti gli RNA trascritti in un particolare ecosistema
• Estrazione di RNA totale
• Conversione in cDNA mediante trascrizione inversa
• Sequenziamento dei cDNA e analisi
Metaproteomica: misura della diversità e abbondanza di differenti proteine in una comunità microbica
• Estrazione delle proteine totali
• Separazione delle proteine
• Identificazione delle sequenze amminoacidiche
Metabolomica: analisi completa di tutti i metaboliti intracellulari/extracellulari in una comunità microbica
• Metodi analitici tipo HPLC/MS • 1H-NMR
Quali sono le interazioni microbiche?
Tra le interazioni microbiche abbiamo la simbiosi= interazioni di microorganismi con altri o micro e macro, possono essere intermittenti, cicliche o permanenti.
La convolutione è un processo di influenza reciproca tra microorganismi e ospiti avvenuti nel corso dell’evoluzione.
La riduzione genomica invece è quando il simbionte (dopo aver stabilito una relazione stabile con l’ospite) tende ad eliminare la sua informazione genomica non utilizzata)
Esistono vari tipi di simbiosi:
- Mutualismo: beneficiano entrambi gli organismi.
Es. I consorzi fototrofi mobili ovvero un mutualismo che si forma tra batteri verdi sulfurei sessili e batteri chemioorganotrofi mobili, i consorzi si muovono lungo l’asse verticale della colonna d’acqua con chemiotassi positiva verso la luce e solfuro, i batteri fototrofi fissano CO2 e trasferiscono nutrienti al chemiotrofo, sono molto comuni nei laghi/acque dolci, fino al 70% della biomassa, anche i noduli radicali delle leguminose sono una simbiosi mutualistica.
-Cooperazione: è una simbiosi non obbligata, dove beneficiano entrambi i microorganismi, come esempio azotobacter e cellulomonas (l’azotobacter fa fissazione di azoto e rilascia ioni NH4+) (cellulomonas ne trae beneficio e produce glucosio)
-Commensalismo: dove un organismo trae beneficio e l’altro non ha né danni ne vantaggi, es. nitrobacter (fa nitrito OX con NO2) trae beneficio dall’associazione con nitrosomonas (fa ammonio OX con NH3)
-Predazione: dove un organismo preda un altro, come Predatore periplasmico Bdellovibrio
che preda i batteri Gram –, Assimila nucleotidi, acidi grassi, peptidi dalla preda.
-Parassitismo: L’organismo parassita trae beneficio dalla simbiosi, l’ospite viene danneggiato.
Comunque c’è sempre una forma di coesistenza in equilibrio tra ospite e parassita.
Batteriofagi: parassiti intracellulari obbligati
-Competizione: dove organismi diversi cercano di acquisire una stessa risorsa:
-nutriente limitante
-spazio
Comunità di microrganismi in ambienti naturali
Anche Microbiota vs patogeni.
-Amensalismo: Relazione sfavorevole di un organismo verso un altro.
Si basa su rilascio di un composto che ha effetto negativo su un altro organismo.
Produzione di acidi organici durante la fermentazione che, diminuendo il pH, ostacolano la crescita di altri microrganismi (conservazione del latte, lattobacilli in ambiente vaginale)
Produzione di antibiotici Produzione di batteriocine
