Microscopy

Question 1

Τι είναι φως;

Answer 1

Είναι ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία. Κάθε ηλεκτρομαγνητικό
κύμα απαρτίζεται από ένα ηλεκτρικό (Ε) και ένα μαγνητικό (Β)
πεδίο των οποίων οι εντάσεις αυξομοιούνται ακολουθώντας
ημιτονοειδή καμπύλη σε χρόνο ή χώρο
Αυτό που περιγράφουμε ως «φως» είναι το ορατό τμήμα της
ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας με μήκη κύματος μεταξύ 400 nm
και 700 nm

Question 2

Βασικές ιδιότητες του φωτός:

Μήκος κύματος ;

Answer 2

To μήκος κύματος (λ),
είναι η απόσταση που διανύει το ηλεκτρομαγνητικό κύμα σε χρόνο μιας Περιόδου
Συχνότητα (ν),
είναι ο αριθμός των κύκλων ανά δευτερόλεπτο (ν=1/λ)
Το μήκος κύματος (ή τη συχνότητα) της ακτινοβολίας το αντιλαμβανόμαστε ως χρώμα
λ
c = νλ (c = 3 X 107 m/sec)
Ε = hν (h = 6.62 X 10-27 erg . sec)
E = hc/λ

Question 3

Βασικές ιδιότητες του φωτός:

Ένταση ;

Answer 3

Η ένταση του φωτός (Intensity, I) είναι ανάλογη του πλάτους
(amplitude, A) της ταλάντωσης του ηλεκτρομαγνητικού κύματος
Την ένταση της ακτινοβολίας την αντιλαμβανόμαστε ως φωτεινότητα
Ι ανάλογο Α2

Question 4

Βασικές ιδιότητες του φωτός:

Πόλωση;

Answer 4

Πόλωση του φωτός.
• Μη πολωμένο φως: αποτελείται από ηλεκτρομαγνητικά κύματα των οποίων
οι φορείς ηλεκτρικού πεδίου (Ε) ταλαντώνονται σε όλες τις δυνατές γωνίες ως
προς τον άξονα διάδοσης του κύματος
• Πολωμένο φως: οι φορείς ηλεκτρικού πεδίου ταλαντώνονται σε επίπεδα
παράλληλα μεταξύ τους. Η πόλωση δεν γίνεται αντιληπτή με το μάτι
Laser: Μονοχρωματικό και πολωμένο φως

Question 5

Το μάτι του ανθρώπου από τι αποτελείται ;

Answer 5

υδατοειδές υγρό , φακός, υαλώδες σώμα, μύες του ματιού , σκληρός χιτώνας , ίριδα , κερατοειδής χιτώνας , μύες του φακού

Question 6

Τι κάνει ο αμφιβλιστροειδής χιτώνας στο μάτι ;

Answer 6

έχει τους φωτοϋποδοχείς ( ραβδία, κωνία)

Question 7

Τι κάνει το διαφραγμα της ίριδας στο μάτι ;

Answer 7

Ρυθμίζει την ποσότητα του φωτός που

μπαίνει στο μάτι

Question 8

Τι κάνει ο χοριώδης χιτώνας για το μάτι

Answer 8

Το αγγειακό στρώμα του ματιού
τροφοδοτεί με οξυγόνο και θρεπτικές
ουσίες τον Αμφιβληστροειδή

Question 9

Τι κάνει ο σκληρός χιτώνας του ματιού;

Answer 9

ινώδης χιτώνας, δομική σταθερότητα,

το «ασπράδι» του ματιού

Question 10

Τι κάνει το μελάχρουν επιθύλιο στο μάτι ;

Answer 10

Σκοτεινόχρωμη χρωστική μελανίνη του χοριοειδή,
βοηθά στο να περιορίζονται οι ανακλάσεις φωτός στο
εσωτερικό του ματιού και να βελτιώνεται η ποιότητα
της όρασης (εκεί ακουμπούν οι βάσεις των φωτουποδοχέων)

Question 11

Πως λέγεται ο φακός του ματιού ;

Answer 11

Κρυσταλλοειδής φακός

Question 12

Ποια είναι η μικρότερη διάσταση αντικειμένου μπου μπορούμε να διακρίνουμε στα 25 cm

Answer 12

0,1 mm

Question 13

τι διαφορά στις τάξεις μεγέθους φωτεινότητας μπορεί να διακρίνει το μάτι

Answer 13

10

Question 14

Χάρη σε τι μπορεί το μάτι να βλέπει στερρεοσκοπικά;

Answer 14

Χάρις στο Οπτικό
Χίασμα παρατηρούμε
στερεοσκοπικά (έχουμε
αντίληψη του βάθους) και από
το ένα μόνο μάτι αφού οι νευρικές ίνες από κάθε μάτι
διασταυρώνονται και
καταλήγουν οι μισές στον οπτικό
φλοιό του ενός ημισφαιρίου του
εγκεφάλου και οι άλλες μισές
στον οπτικό φλοιό του άλλου
ημισφαιρίου

Question 15

Ποιος φωτουποδοχέας είναι υπεύθυνος για όραση σε έντονο φως ;

Answer 15

κωνίο

Question 16

Ποιος φωτουποδοχέας είναι υπεύθυνος για όρασης σε αμυδρό φως;

Answer 16

ραβδίο

Question 17

Σε ποιο σημείο του αμφιβληστροειδή έχουμε ελάχιστα ραβδία και πολλά κωνία ;

Answer 17

Στο κεντρικό βοθρίο

Question 18

ποιο είδος φωτουποδοχέα είναι ποιο συχνό στα περισότερα σημεία του αμφιβληστροειδούς πλην του κεντρικού βοθρίου

Answer 18

Τα ραβδία

Question 19

φωτευαίσθητη χρωστική των ραβδίων ;

Answer 19

ροδοψίνη

Question 20

φωτουποδοχείς με μεγαλύτερη ευαισθησία και βραδύτερη απόκριση

Answer 20

ραβδία

Question 21

Τι είναι η αντίληψη της αντίθεσης ;

Answer 21

Για να γίνει αντιληπτό το αντικείμενο που παρατηρούμε πρέπει η
φωτεινότητά του να διαφέρει από αυτή του υποβάθρου (background)
και των άλλων αντικειμένων τριγύρω, δηλαδή να παρουσιάζει
αντίθεση (contrast, C)

Question 22

Τι είναι το κατώφλι αντίθεσης ;

Answer 22

Για να γίνει αντιληπτό ένα
αντικείμενο σε καλές συνθήκες φωτισμού πρέπει C > 2-5% ενώ σε χαμηλό
φωτισμό πρέπει C > 200-300%

C = ΔΙ / Ιb
C: Αντίθεση
ΔΙ = Iobj- Ib
Iobj: Φωτεινότητα αντικειμένου
Ιb: Φωτεινότητα υποβάθρου (background)

Question 23

Ποια είναι τα πρωταρχικά και ποια τα δευτερογενή χρώματα ;

Answer 23

μπλε, πράσινο και κόκκινο (πρωταρχικά ή κύρια χρώματα

κυανό (γαλάζιο, μπλε-πράσινο, cyan), κίτρινο και
ιώδες (μωβ, magenta)

Question 24

Πώς αντιλαμβάνεται το μάτι τα πρωταρχικά χρώματα;

Answer 24

Ανάλογα με το μήκος κύματος, η ακτινοβολία απορροφάται από την
κατάλληλη φωτοευαίσθητη χρωστική στα αντίστοιχου είδους κωνία και
οδηγεί σε έκκριση νευροδιαβιβαστών, μεταφορά του σήματος στον
εγκέφαλο και μετάφραση αυτού ως μπλε, πράσινο, κόκκινο χρώμα ή
συνδυασμό χρωμάτων
S-κωνία (μπλε, 419 nm)
Μ-κωνία (πράσινο, 531 nm)
L-κωνία (κόκκινο, 559 nm)

Question 25

Πώς προκύπτουν τα δευτερογενή χρώματα σύμφωνα με τον προσθετικό τρόπο ;

Answer 25

Εφαρμόζεται όταν το μάτι κοιτάζει μια πηγή φωτεινής ακτινοβολίας. Φως ακτινοβολείται στο μάτι κατευθείαν από την πηγή. Ο τρόπος αυτός χρησιμοποιείται από τις οθόνες τηλεοράσεων και υπολογιστών • Η μπλε, πράσινη ή κόκκινη ακτινοβολία ακτινοβολία ενεργοποιεί τα κωνία του ματιού (μπλε, πράσινες και κόκκινες φωτοευαίσθητες χρωστικές αντίστοιχα) και μεταφράζεται ως χρώμα • Αναμιγνύοντας (προσθέτοντας) διαφορετικές εντάσεις μπλε, πράσινης και κόκκινης ακτινοβολίας ενεργοποιείται συνδυασμός χρωστικών στα κωνία και παράγονται τα δευτερεύοντα χρώματα κυανό, κίτρινο και magenta. Όταν και τα τρία είδη κωνίων ενεργοποιούνται εξίσου, αντιλαμβανόμαστε το χρώμα ως λευκό. Έλλειψη ακτινοβολίας = μαύρο

Question 26

Πώς προκύπτουν τα χρώματα σύμφωνα με τον αφαιρετικό τρόπο ;

Answer 26

Εφαρμόζεται όταν το μάτι κοιτάζει ένα αντικείμενο το οποίο δεν αποτελεί πηγή φωτεινής ακτινοβολίας. Φως από μία φωτεινή πηγή προσπίπτει στο αντικείμενο (το φωτίζει) και η ακτινοβολία που ανακλάται προσλαμβάνεται από το μάτι • Φωτογραφίες, πίνακες, αντικείμενα στο φυσικό περιβάλλον φαίνονται έγχρωμα διότι απορροφούν ορισμένα μήκη κύματος φωτός ενώ ανακλούν άλλα στο δέκτη (μάτι) • Παράδειγμα: Το μήλο φαίνεται κόκκινο διότι ανακλά την ακτινοβολία του φωτός που αντιστοιχεί στο κόκκινο ενώ απορροφά (αφαιρεί) τις υπόλοιπες. Η ακτινοβολία αυτή φτάνει στο μάτι, ενεργοποιεί την κόκκινη φωτοευαίσθητη χρωστική των κωνίων και γίνεται αντιληπτή ως κόκκινο χρώμα

Question 27

Σύμφωνα με την αφαιρετική μέθοδο πότε βλέπουμε ένα αντικείμενο λευκό κια πότε μαύρο ;

Answer 27

``` Ένα αντικείμενο φαίνεται μαύρο όταν όλες οι ακτινοβολίες του ορατού φάσματος του φωτός απορροφώνται από αυτό και καμία ακτινοβολία δε φτάνει στο μάτι ``` ``` Ένα αντικείμενο φαίνεται λευκό όταν όλες οι ακτινοβολίες του ορατού φάσματος του φωτός ανακλώνται και φτάνουν στο μάτι όπου ενεργοποιούν και τα τρία είδη φωτοευαίσθητων χρωστικών των κωνίων ```

Question 28

Εκτροπές ακτίνας φωτός: Τι είναι Διάθλαση;(refraction)

Answer 28

Ακτίνα φωτός η οποία προσπίπτει σε κάποιο υλικό, αλλάζει πορεία και διέρχεται μέσα από αυτό. Η γωνία διάθλασης εξαρτάται από το είδος του υλικού

Question 29

Εκτροπές ακτίνας φωτός: Τι είναι Ανάκλαση;(reflection)

Answer 29

Ακτίνα φωτός η οποία προσπίπτει σε κάποιο υλικό, αλλάζει πορεία αλλά δεν διέρχεται μέσα από αυτό. Η γωνία ανάκλασης ισούται με τη γωνία πρόσπτωσης

Question 30

Ποια είναι η πορεία που ακολουθεί το φως σε ένα μικροσκόπιο και γιατί μπορούμε με αυτό να βλέπουμε πράγματα μη ορατά με την απλή όραση ;

Answer 30

``` Στο μικροσκόπιο, φως από το αντικείμενο (Α) περνά από τον αντικειμενικό φακό (objective lens, 2), τον φακό του σωλήνα του μικροσκοπίου όταν αυτός υπάρχει (tube lens, 3), δημιουργείται μεγεθυμένη ενδιάμεση εικόνα (4) η οποία δεσμεύεται από τον προσοφθάλμιο φακό (eyepiece lens, 5) και απεικονίζεται στο μάτι (6) ``` ``` Η οπτική γωνία δ1>>δ2 στον αμφιβληστροειδή, συνεπώς «αθέατες» λεπτομέρειες του παρασκευάσματος κατά την παρατήρηση με γυμνό μάτι (περίπτωση Β) γίνονται ορατές με χρήση μικροσκοπίου (περίπτωση Α) ```

Question 31

Πως είναι κάθε φακός του μικροσκοπίου και πως ονομάζονται τα είδη τους ανάλογα με το σχήμα ;

Answer 31

Κάθε «φακός» μικροσκοπίου είναι σύνθετος και παχύς και φτιάχνεται από συγκόλληση πολλών διαφορετικών φακών Αμφίκυρτος Επιπεδόκυρτος Κοιλόκυρτος θετικός μηνίσκος Αμφίκοιλος Επιπεδόκοιλος Κοιλόκυρτος αρνητικός μηνίσκος

Question 32

Ποιες είναι οι αρχές της γεωμετρικής οπτικής απλού, | λεπτού και αμφίκυρτου φακού ;

Answer 32

Λεπτός αμφίκυρτος φακός, οπτικό κέντρο (κέντρο του φακού), οπτικός άξονας • Διάθλαση ακτίνων φωτός. Εστιακό κέντρο (Focal point, F), εμπρός και πίσω • Εστιακό μήκος, f (απόσταση του F από τον φακό) Το εμπρόσθιο εστιακό μήκος = οπίσθιο εστιακό μήκος όταν ο φακός είναι αμφίκυρτος • Απόσταση αντικειμένου-φακού (α) και απόσταση ειδώλου-φακού (b)

Question 33

Ποιές είναι οι αρχές διάδοσης ακτινών στους | λεπτούς αμφίκυρτους φακούς;

Answer 33

``` (a) Ακτίνα που περνά από το οπτικό κέντρο δεν διαθλάται (b) Ακτίνα που προσπίπτει παράλληλα με τον οπτικό άξονα διαθλάται και περνά από το πίσω εστιακό κέντρο (c) Ακτίνα που διέρχεται από το εμπρός εστιακό κέντρο διαθλάται παράλληλα με τον οπτικό άξονα (d) Το επίπεδο του ειδώλου (εικόνας) καθορίζεται από την τομή δύο από των τριών παραπάνω ακτινών ```

Question 34

Ποιες μαθηματικές σχέσεις συνδέουν την εικόνα και το αντικείμενο όσο αφορά τη μεγέθυνση αυτού ;(αμφικυρτος φακός)

Answer 34

``` Μ: Μεγέθυνση (magnification) M = b/α 1/f = 1/α + 1/b M = f/(α-f) Η Μεγέθυνση εξαρτάται από τη θέση του αντικειμένου στον οπτικό άξονα!!! ```

Question 35

Παραδείγματα σχέσεων αντικειμένου- | εικόνας : M>1

Answer 35

Κλασσικός αντικειμενικός φακός Real magnified image 2f>α>f

Question 36

Παραδείγματα σχέσεων αντικειμένου- | εικόνας : M<1

Answer 36

Real demagnified image | α>2f

Question 37

Παραδείγματα σχέσεων αντικειμένου- | εικόνας : [M]>1

Answer 37

Κλασσικός προσοφθάλμιος φακός Virtual magnified image α

Question 38

Αντικειμενικός φακός ICS (Image distance ∞) : τι σχέση έχει το a με το f ;

Answer 38

α=f

Question 39

Ποια είναι η συστοιχεία φακών ενός συνηθισμένου μικροσκοπίου ;

Answer 39

• Το αντικείμενο σε απόσταση 2f>α>f και η ενδιάμεση εικόνα | σε α’

Question 40

Πως λειτουργεί ένα Modern microscope with ICS (Infinity Colour corrected System) (infinity optics) ;

Answer 40

Στα σύγχρονα μικροσκόπια υπάρχει ένας φακός στο σωλήνα (tube lens) ο οποίος δρα μαζί με τον αντικειμενικό φακό: οι ακτίνες φωτός μετά τον αντικειμενικό φακό τρέχουν παράλληλα (αντικείμενο σε απόσταση α = f) έως να διαθλαστούν από τον tube lens • Θεωρητικά ο σωλήνας του μικροσκοπίου μπορεί να έχει μήκος «άπειρο». Στην πράξη 160-200 mm, μετά η εικόνα σκοτεινιάζει και γίνεται θολή • Ο αντικειμενικός μαζί με τον tube lens παράγουν την πλήρως διορθωμένη από οπτικά σφάλματα ενδιάμεση εικόνα. Αυτό επιτρέπει την προσθήκη επιπλέον οπτικών τμημάτων (όπως φίλτρα φθορισμού) χωρίς να απαιτείται διόρθωση των οπτικών σφαλμάτων που τα τμήματα αυτά επιφέρουν από τον προσοφθάλμιο φακό • Τα κλασικά μικροσκόπια με “finite optics” απαιτούν πολλές διορθώσεις οπτικών σφαλμάτων της εικόνας από τον προσοφθάλμιο φακό

Question 41

Ποια είναι τα είδη οπτικών σφαλμάτων και πως διορθώνονται ;

Answer 41

• Οι απλοί φακοί έχουν σφαιρικές επιφάνειες οι οποίες συσχετίζονται με οπτικά σφάλματα: διαταραχές της εικόνας (aberrations) και παραμορφώσεις (distortions) • Επιδιόρθωση των σφαλμάτων γίνεται πρωταρχικά από τον αντικειμενικό φακό, o οποίος είναι σύνθετος και αποτελείται από επιμέρους φακούς • Τα υπόλοιπα οπτικά σφάλματα μετά το πέρασμα της φωτεινής δέσμης από τον αντικειμενικό φακό διορθώνονται από τον tube lens • Στα οπτικά σφάλματα περιλαμβάνονται σφαιρικές διαταραχές, χρωματικές διαταραχές και παραμόρφωση του οπτικού πεδίου

Question 42

Διαταραχές εικόνας: Σφαιρικές | διαταραχές τι είναι ;

Answer 42

• Οι σφαιρικές επιφάνειες των φακών (η μόνη πρακτική προσέγγιση για τον κατασκευαστή) έχουν ως αποτέλεσμα παράλληλες ακτίνες οι οποίες προσπίπτουν στο κέντρο ή την περιφέρεια του φακού να εστιάζονται σε ελαφρώς διαφορετικά σημεία του οπτικού άξονα • Αποτέλεσμα των σφαιρικών διαταραχών είναι κάθε φωτεινό σημείο να περιβάλλεται από φωτεινό στεφάνι ή σειρά φωτεινών δακτυλίων και η εικόνα να φαίνεται θολή

Question 43

Διαταραχές εικόνας: Χρωματικές | διαταραχές ;

Answer 43

• Ο φακός διαθλά τις ακτίνες φωτός με διαφορετικό τρόπο ανάλογα με το μήκος κύματός τους. Το μπλε φως διαθλάται στο εσωτερικό του οπτικού άξονα σε σχέση με το ερυθρό φως, ενώ το πράσινο διαθλάται σε ενδιάμεσο σημείο του οπτικού άξονα • Αποτέλεσμα των χρωματικών διαταραχών είναι κάθε φωτεινό σημείο να περιβάλλεται από στεφάνι χρωμάτων, το χρώμα αυτού να μεταβάλλεται ανάλογα με το σημείο εστίασης του αντικειμενικού φακού και η εικόνα να φαίνεται θολή

Question 44

Τι είναι η Παραμόρφωση του οπτικού | πεδίου ;

Answer 44

• Είναι σφάλμα κατά το οποίο το αντικείμενο δεν απεικονίζεται σε επίπεδη (flat-field) αλλά σφαιρική επιφάνεια • Δεν μπορούμε να εστιάσουμε σε όλη την εικόνα αλλά μόνο σε τμήμα αυτής

Question 45

Αναφέρετε δύο από τα κυριότερα κριτήρια ποιότητας ενός | αντικειμενικού φακού .

Answer 45

Διόρθωση σφαιρικών και χρωματικών διαταραχών (aberration correction) Επιπεδότητα της ενδιάμεσης εικόνας (διόρθωση της παραμόρφωσης πεδίου, flat-field correction)

Question 46

Ποια είναι τα είδη αντικειμενικών φακών ;

Answer 46

Achromats Achroplans Plan-Neofluar Plan-Apochromat

Question 47

Ποια είναι τα χαρακτηριστικά των Achromats φακών ;

Answer 47

Kαλή διόρθωση χρωματικών σφαλμάτων για κόκκινο (656 nm) και μπλε (486 nm) μήκη κύματος. Διόρθωση σφαιρικών διαταραχών για το πράσινο-κίτρινο (540 nm). Καλή επιπεδότητα στο κέντρο της εικόνας, απαιτείται επανεστίαση για την περιφέρεια της εικόνας. Οικονομικότεροι όλων των άλλων

Question 48

Ποια είναι τα χαρακτηριστικά των Achroplans φακών ;

Answer 48

Βελτιωμένοι Αchromat με καλή επιπεδότητα εικόνας σε όλο το εύρος του πεδίου. Χρησιμοποιούνται σε μικροσκοπία αντίθεσης φάσεως (phase contrast microscopy, Achroplan-Ph)

Question 49

Ποια είναι τα χαρακτηριστικά των Plan-Neofluar φακών ;

Answer 49

Εξαιρετική διόρθωση χρωματικών σφαλμάτων για κόκκινο, πράσινο και μπλε χρώμα. Εξαιρετική επιπεδότητα εικόνας για όλο το οπτικό πεδίο. Διαπερατοί από υπεριώδη ακτινοβολία (UV, 365 nm) γεγονός σημαντικό για πειράματα φθορισμού. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε ποικίλες μεθόδους μικροσκοπίας όπως φθορισμού, Differential Interference Contrast (DIC), time-lapse microscopy, κ.ά.

Question 50

Ποια είναι τα χαρακτηριστικά των Plan-Apochromat φακών ;

Answer 50

Εξαιρετικοί και πολύ ακριβοί φακοί. Εξαιρετική διόρθωση χρωματικών σφαλμάτων για κόκκινο, πράσινο, μπλε και βαθύ μπλε χρώμα. Τέλεια επιπεδότητα εικόνας. Με αυτούς επιτυγχάνεται η καλύτερη δυνατή διακριτική ικανότητα. Χρησιμοποιούνται σε συνεστιακή μικροσκοπία (confocal microscopy) και όλες τις σύγχρονες εξειδικευμένες εφαρμογές όπως Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM), Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP), Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF), κ.ά.

Question 51

Ποια πλεονεκτήματα έχουν οι Plan-Apochromat σε σχέση με τους Achroplan αντικειμενικούς φακούς ;

Answer 51

Οι Plan-Apochromat φακοί περιέχουν 12 ή περισσότερα στοιχεία φακών ώστε να επιτύχουν την καλύτερη δυνατή διόρθωση χρωματικών σφαλμάτων σε όλο το φάσμα του ορατού φωτός και τέλεια επιπεδότητα εικόνας. Οι Achroplan φακοί αποτελούνται από λιγότερα τμήματα

Question 52

Πως ορίζεται η μεγέθυνση του μικροσκοπείου ;

Answer 52

Μεγέθυνση από τον αντικειμενικό φακό x Μεγέθυνση από τον προσοφθάλμιο φακό Προσοχή: Μεγαλύτερη μεγέθυνση δεν σημαίνει απαραίτητα καλύτερη παρατήρηση των λεπτομερειών του παρασκευάσματος!!

Question 53

Τι είναι διακριτικό όριο;

Answer 53

Είναι η ελάχιστη απόσταση στην οποία δύο σημεία μπορούν να γίνουν αντιληπτά ως ξεχωριστά Θεωρητικά η απόσταση αυτή τείνει στο μηδέν. Στην πράξη, λόγω του φαινόμενου της περίθλασης (diffraction) κάθε φωτεινό σημείο απεικονίζεται ως κηλίδα φωτός (δίσκος περίθλασης Airy) η οποία περιβάλλεται από ομόκεντρα δαχτυλίδια περίθλασης

Question 54

Από τι εξαρτάται το Διακριτικό όριο του μικροσκοπίου

Answer 54

Στην πράξη το διακριτικό όριο (d) ισούται με τη διάμετρο του δίσκου Airy Δεν υπάρχει φακός που να μπορεί να διορθώσει το φαινόμενο της περίθλασης Το διακριτικό όριο του αντικειμενικού φακού, d (και κατά συνέπεια του μικροσκοπίου), εξαρτάται από το μήκος κύματος της φωτεινής ακτινοβολίας (λ) και το αριθμητικό άνοιγμα του φακού (Numerical Aperture, NA) d = 1.22 λ/2NA Μεγαλύτερο ΝΑ = μικρότερο d, άρα καλύτερη παρατήρηση μικρότερων λεπτομερειών του αντικειμένου!!

Question 55

Τι είναι το Αριθμητικό άνοιγμα του φακού;

Answer 55

Είναι ένα νούμερο που χαρακτηρίζει τη μέγιστη γωνία με την οποία ο αντικειμενικός φακός μπορεί να δεχτεί φως από το παρασκεύασμα ΝΑ = n sinθ Και n είναι ο δείκτης διάθλασης του μέσου μέσα στο οποίο ευρίσκεται ο φακός Όπου θ είναι η γωνία που σχηματίζει η οριακή ακτίνα με τον οπτικό άξονα

Question 56

Τι είναι ο δείκτης διάθλασης ;

Answer 56

Ο δείκτης διάθλασης n είναι ένα μέτρο του πόσο ελαττώνεται η ταχύτητα του φωτός κατά τη διέλευση αυτού από ένα μέσο. Για παράδειγμα: Για κενό (ή αέρα) n = 1.00 (ξηροί, dry objectives) Για νερό n = 1.33 (υδατοκαταδυτικοί, water objectives) Για καλυπτρίδα n = 1.52 (ελαιοκαταδυτικοί, oil objectives) Θεωρητικά θmax θεωρητικό = 90ο, συνεπώς ΝΑmax θεωρητικό= n Στην πράξη θmax πραγματικό ~ 70ο, συνεπώς ΝΑmax πραγματικό < n

Question 57

Το αριθμητικό άνοιγμα ή η | μεγέθυνση καθορίζουν το διακριτικό όριο;

Answer 57

Αντικειμενικός φακός με μεγαλύτερο NA συγκεντρώνει περισσότερο φως από το παρασκεύασμα και διακρίνει μικρότερες λεπτομέρειες

Question 58

Ένας αντικειμενικός φακός 40Χ με ΝΑ = 0.65 τι προσοφθάλμιο φακό χρειάζεται ώστε να αξιοποιήσουμε πλήρως τις δυνατότητές του;

Answer 58

Εμπειρικός κανόνας: Για να εκμεταλλευτούμε το ΝΑ του φακού απαιτείται μεγέθυνση μικροσκοπίου 1000 Χ ΝΑ (μέγιστη ωφέλιμη μεγέθυνση) Πάνω από τη μέγιστη ωφέλιμη μεγέθυνση η εικόνα μεγαλώνει αλλά δεν διακρίνουμε περισσότερες λεπτομέρειες του αντικειμένου Απαιτείται μέγιστη ωφέλιμη μεγέθυνση περίπου 1000 Χ 0.65 = 650 Μεγέθυνση μικροσκοπίου = Μεγέθυνση αντικειμενικού Χ Μεγέθυνση προσοφθάλμιου Δηλαδή: 650 = 40 Χ Μεγέθυνση προσοφθάλμιου, άρα χρειάζεται προσοφθάλμιος περίπου 16Χ

Question 59

Τι πρέπει να γνωρίζουμε για την απόσταση εργασίας αντικειμενικών φακών ;

Answer 59

• Γενικά η απόσταση εργασίας μειώνεται καθώς η μεγέθυνση και το αριθμητικό άνοιγμα αυξάνονται • Μεγαλύτερες αποστάσεις εργασίας απαιτούνται όταν παρατηρούμε παρασκευάσματα μέσα από χοντρά τοιχώματα (π.χ. στη χημεία ή μεταλλουργία) • Οι καταδυτικοί φακοί απαιτούν μικρότερες αποστάσεις εργασίας από τους ξηρούς φακούς ώστε να υπάρχει ένα ομοιόμορφο υγρό μέσο μεταξύ παρασκευάσματος και φακού αλλά δύνανται να επιτύχουν καλύτερο διακριτικό όριο

Question 60

Ποια είναι τα βασικά εξαρτήματα του μικροσκοπίου που εξυπηρετούν τον φωτισμό ;

Answer 60

Condenser lens, Condenser diaphragm and | screws, Lamp switch, field stop diaphragm

Question 61

Ποιοι παράγοντες παίζουν ρόλο στον βέλτιστο φωτισμό ενός δείγματος ;

Answer 61

``` • Ομοιογενής φωτισμός του δείγματος • Μεγαλύτερη μεγέθυνση = μεγαλύτερο εύρος πεδίου και απαιτείται εντονότερος φωτισμός • «Επιπλέον» φως εκτός οπτικού πεδίου μειώνει τη ικανότητα παρατήρησης λόγω εσωτερικών ανακλάσεων • Απαιτείται ισορροπία μεταξύ ικανής έντασης φωτός (intensity) και βέλτιστης αντίθεσης εικόνας (contrast) ```

Question 62

Από τι ρυθμίζεται ο φωτισμός σε ένα οπτικό μικροσκόπιο;

Answer 62

Ο φωτισμός του δέιγματος στο οπτικό μικροσκόπιο ρυθμίζεται από τον πυκνωτή (condenser) και το διάφραγμα πεδίου (field stop diaphragm)

Question 63

Πως ο φωτισμός Köhler πετυχαίνει το βέλτιστο φωτισμό ;

Answer 63

Με τον φωτισμό Köhler πετυχαίνουμε να έχουμε τόσο φως ώστε να μην προκαλεί εσωτερικές ανακλάσεις που μειώνουν την αντίθεση και ταυτόχρονα ιδανική τοποθέτηση του πυκνωτή ώστε με την ρύθμιση του διαφράγματος του να επιτυγχάνουμε ιδανική σχέση αντίθεσης – διακριτικής ικανότητας

Question 64

Περιγράψτε τα 5 στάδια επίτευξης φωτισμού Köhler .

Answer 64

``` 1) Αρχική εικόνα χωρίς φωτισμό Köhler Εστιάζουμε στο παρασκεύασμα 2)Κλείνουμε το διάφραγμα πεδίου αρκετά ώστε να σκοτεινιάσει το πεδίο αλλά να εξακολουθούμε να βλέπουμε το παρασκεύασμα Κινούμε τον πυκνωτή πάνω-κάτω ώστε να δούμε καθαρή εικόνα 3)Χρησιμοποιώντας τις βίδες προσανατολισμού του πυκνωτή φέρνουμε την εικόνα του διαφράγματος στο κέντρο της εικόνας 4)Ανοίγουμε το διάφραγμα πεδίου όσο απαιτείται ώστε να βλέπουμε ολόκληρο το οπτικό πεδίο 5)Ρυθμίζουμε το διάφραγμα του πυκνωτή ώστε να επιτύχουμε μέγιστη αντίθεση ```

Question 65

Ποιο είναι το κύριο πλεονέκτημα του ανάστροφου μικροσκοπίου ;

Answer 65

Επιτρέπει την παρατήρηση δειγμάτων ζωντανών κυττάρων τα | οποία μεγαλώνουν στον πυθμένα του δοχείου (flask, petri dish, etc)

Question 66

Ποιες είναι οι οπτικές διατάξεις στο οπτικό μικροσκόπιο ;

Answer 66

1. Αντικειμενικός φακός 2. Αντικειμενικός και προσοφθάλμιος φακός 3. Αντικειμενικός και ενδιάμεσος ή προσοφθάλμιος φακός 4. Διάφραγμα φωτεινού πεδίου 5. Διάφραγμα πυκνωτή

Question 67

Ποιες είναι 5 σημαντικές παράμετροι όταν παρατηρούμε σε οπτικό μικροσκόπιο ;

Answer 67

1. Διακριτικό όριο (d) 2. Ωφέλιμη μεγέθυνση 3. Επιδιόρθωση οπτικών σφαλμάτων 4. Φωτεινότητα εικόνας (Ι) 5. Αντίθεση εικόνας (C)

Question 68

Πως παρατηρούμε τα βιολογικά δείγματα όταν τα συστατικά τους είναι σχεδόν διαφανή ;

Answer 68

``` Για να παρατηρήσουμε βιολογικά δείγματα (ζωντανά ή μονιμοποιημένα) πρέπει να δημιουργήσουμε κατάλληλες συνθήκες αντίθεσης (contrast) Ανάλογα με την τεχνική αντίθεσης που επιλέγεται, συχνά απαιτείται σήμανση (χρώση) συστατικών του κυττάρου ```

Question 69

Ποιες είναι οι 6 τεχνικές δημιουργίας κατάλληλων συνθηκών αντίθεσης στο μικροσκόπιο ;

Answer 69

* Μικροσκοπία φωτεινού πεδίου (Brightfield microscopy) * Μικροσκοπία σκοτεινού πεδίου (Darkfield) * Μικροσκοπία αντίθεσης φάσεως (Phase Contrast) * Μικροσκοπία πολωμένου φωτός (Polarization Contrast) * Differential Interference Contrast (DIC) * Μικροσκοπία φθορισμού (Fluorescence Contrast)

Question 70

Μικροσκοπία φωτεινού πεδίου, πως λειτουργεί ;

Answer 70

``` Δέσμη φωτός πέφτει στο παρασκεύασμα, διέρχεται από αυτό και μέσω της οπτικής οδού του μικροσκοπίου η εικόνα φτάνει στο όργανο παρατήρησης (μάτι, camera) ```

Question 71

Ποια είναι τα θετικά και αρνητικά Χαρακτηριστικά της μικροσκοπίας φωτεινού πεδίου και με ποιον τρόπο βελτιώνεται η παρατήρηση σε αυτή ;

Answer 71

Η μικροσκοπία φωτεινού πεδίου απαιτεί απλά (μη εξειδικευμένα) μικροσκόπια και χρήστες • Εύκολη και φτηνή • Εφαρμόζεται ευρέως για την παρατήρηση ιστολογικών δειγμάτων (π.χ. βιοψίες) •Τα βιολογικά δείγματα απορροφούν ελάχιστο φως • Σε φωτεινό υπόβαθρο το μάτι αντιλαμβάνεται διαφορές στην ένταση του φωτός μεγαλύτερες του 10% • Η διαφορά στην ένταση του διερχόμενου φωτός μεταξύ παρασκευάσματος και υποβάθρου είναι μικρή, συνεπώς η αντίθεση είναι μικρή και το παρασκεύασμα δυσδιάκριτο Για παρατήρηση βιολογικών δειγμάτων σε συνθήκες φωτεινού πεδίου απαιτείται χρώση αυτών • Με τη χρώση, οπτικά χαρακτηριστικά του δείγματος τα οποία είναι αόρατα για το μάτι μεταφράζονται σε ορατές διαφορές έντασης του φωτός

Question 72

Ποια είναι τα βασικά στάδια της μικροσκοπίας φωτεινού πεδίου ;

Answer 72

1. Παρασκευή ιστολογικών δειγμάτων | 2. Χρώση ιστολογικών δειγμάτων

Question 73

Ποια είναι τα στάδια της παρασκευής ιστολογικών δειγμάτων ;

Answer 73

1.Μονιμοποίηση Σταματά την αυτόλυση του ιστού Διαφυλάσσει τη δομική σταθερότητα των κυττάρων Κατάλληλα μονιμοποιητικά υλικά είναι αλδεΰδες (φορμαλδεΰδη, γλουταραλδεΰδη), άλατα του υδραργύρου, κ.ά. 2. Αφυδάτωση Σταδιακή αφυδάτωση του ιστού με τη βοήθεια διαλυμάτων αιθανόλης 3. Διαύγαση Ανταλλάσσεται το μέσο αφυδάτωσης με διαλύτη συμβατό με το μέσο έγκλεισης, για παράδειγμα ξυλόλη 4. Έγκλειση Ο ιστός περιβάλλεται με υλικό που του δίνει δομική σταθερότητα ώστε να κόβεται με ακρίβεια σε λεπτές τομές. Για τομές μέχρι 0.5 μm χρησιμοποιείται παραφίνη 5. Μικροτομή Κόψιμο δειγμάτων και συλλογή τομών με τη βοήθεια μικροτόμου και κατάλληλου μαχαιριού από ατσάλι 6. Διάλυση του μέσου έγκλεισης και ενυδάτωση 7. Χρώση ώστε να γίνουν ορατά τα στοιχεία του ιστού 8. Κάλυψη με καλυπτρίδα και παρατήρηση στο οπτικό μικροσκόπιο

Question 74

Τι είναι η μικροτόμος ;

Answer 74

Ο μικροτόμος χρησιμοποιείται για την παραγωγή λεπτών τομών παραφίνης. Υπάρχουν πολλοί τύποι μικροτόμου με πιο σύγχρονο τον περιστροφικό

Question 75

Πως γίνεται παρασκευή τομών παραφίνης ;

Answer 75

1. Μονιμοποίηση με διάλυμα φορμαλδεΰδης (2% – 4%) 2. Σταδιακή αφυδάτωση με διαλύματα 50%, 70%, 90% και 100% αιθανόλης 3. Διαύγαση με ξυλόλη 4. Έγκλειση σε λιωμένη παραφίνη σε ειδικά καψίδια (κασέτες) στους 55 – 65 οC για να εμποτιστεί ο ιστός με παραφίνη 5. Στερεοποίηση σε θερμοκρασία δωματίου και μικροτομή 6. Χρήση τομών για ιστοχημικές ή ανοσοϊστοχημικές χρώσεις

Question 76

Πως γίνεται η παρασκευή κρυοτομών ;

Answer 76

Φρέσκα (όχι μονιμοποιημένα) δείγματα καλύπτονται με ειδικό υδατοδιαλυτό υλικό κάλυψης και παγώνονται με εμβάπτιση σε ισοπεντάνιο στους -40 οC με χρήση ξηρού πάγου ή υγρού αζώτου Τα δείγματα κόβονται σε θερμοκρασία -10 οC έως -30 οC και συλλέγονται σε αντικειμενοφόρους πλάκες για ιστολογική ή ανοσο-ιστοχημική ανάλυση Στις κρυοτομές η δομή του ιστού δεν διατηρείται τόσο καλά όσο σε αυτές της παραφίνης, είναι όμως ευκολότερες και ταχύτερες στην παρασκευή (π.χ. ταχείες βιοψίες)

Question 77

Τι είναι ο κρυοστατικός μικροτόμος ;

Answer 77

``` Ο κρυοστατικός μικροτόμος είναι τοποθετημένος σε ένα καταψύκτη ώστε να διατηρούνται χαμηλές θερμοκρασίες κατά το κόψιμο του δείγματος ```

Question 78

Ιστοχημεία (Histochemistry) τι είναι ;

Answer 78

Είναι η παρατήρηση της μορφολογίας κυττάρων ή ιστών στο οπτικό μικροσκόπιο μετά από χρήση χρωστικών (χρώση δειγμάτων με χρωστικές)

Question 79

Τι γνωρίζετε για την χρώση Αιματοξυλίνης-Ιωσίνης (Haematoxylin-Eosin) ;

Answer 79

``` Η χρώση Αιματοξυλίνης-Ιωσίνης (Haematoxylin-Eosin) είναι από τις πιο διαδεδομένες στην Ιστολογία. Χρησιμοποιείται για γενική εκτίμηση της εικόνας του ιστού Η Αιματοξυλίνη προσδένεται σε νουκλεϊκά οξέα και χρωματίζει μπλε περιοχές όπως ο πυρήνας και τα ριβοσώματα Η Ιωσίνη προσδένεται σε πρωτεΐνες και χρωματίζει ροζ το κυτταρόπλασμα και έντονα κόκκινα τα ερυθροκύτταρα ```

Question 80

Τι είναι Ανοσοϊστοχημεία | (Immunohistochemistry, IHC) και από τι εξαρτάται ;

Answer 80

Είναι ο εντοπισμός συγκεκριμένων πρωτεϊνικών αντιγόνων σε δείγματα κυττάρων ή ιστών με χρήση κατάλληλων αντισωμάτων συνδεδεμένων με χρωμοφόρες ουσίες (χρώση με αντισώματα συνδεδεμένα σε χρωμοφόρες ουσίες, π.χ. υπεροξειδάση) Η μέθοδος εξαρτάται από την ειδικότητα του αντισώματος

Question 81

Ποια είναι μία πολύ σημαντική εφαρμογή της Ανοσοϊστοχημείας στην χειρουργική παθολογία ;

Answer 81

Χρησιμοποιείται ευρέως για τη διάγνωση και ταυτοποίηση νεοπλασιών Έκφραση συγκεκριμένων πρωτεϊνών χαρακτηρίζει την ύπαρξη νεοπλασιών ή και το είδος της νεοπλασίας. Τέτοια πρωτεϊνικά αντιγόνα (καρκινικοί δείκτες) δύνανται να ανιχνευθούν με ανοσοϊστοχημεία σε ιστολογικά δείγματα ασθενών Παραδείγματα καρκινικών δεικτών: • Carcinoembryonic antigen (CEA): Ταυτοποίηση αδενοκαρκινωμάτων οποιασδήποτε προέλευσης • CD117 (KIT): Καρκίνος του συνδετικού ιστού του γαστρικού συστήματος και του λεπτού εντέρου

Question 82

Τι γνωρίζεται για τον καρκινικό δείκτη CEA ;

Answer 82

``` Είναι διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη η οποία συμμετέχει στην κυτταρική πρόσδεση (cell adhesion). Εκφράζεται κατά την εμβρυική ανάπτυξη και η παραγωγή της σταματά πριν τη γέννηση Υπερέκφραση του CEA εμφανίζεται σε νεοπλασίες του γαστρικού συστήματος, του παχέος εντέρου, των πνευμόνων, του ήπατος και του στήθους Δείγματα με υψηλά επίπεδα CEA εντοπίζονται με ανοσοϊστοχημεία με χρήση ειδικών μονοκλωνικών αντισωμάτων ```

Question 83

Τι γνωρίζεται για τον καρκινικό δείκτη CD117 (KIT) ;

Answer 83

Είναι διαμεμβρανικός υποδοχέας της κυτοκίνης SCF (stem cell factor). Έχει ενεργότητα κινάσης Τυροσίνης και συμμετέχει στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό Υπερέκφραση της πρωτεΐνης KIT εμφανίζεται σε ποσοστό 85-90% καρκίνων του συνδετικού ιστού του γαστρικού συστήματος και του λεπτού εντέρου (gastrointestinal stromal tumour, GIST)

Question 84

Πως λειτουργεί η Μικροσκοπία φωτεινού πεδίου | (Brightfield microscopy) ;

Answer 84

Η φωτεινή δέσμη περνά από τη διάταξη του πυκνωτή, ο κώνος φωτός πέφτει στο αντικείμενο παρατήρησης και όλες οι ακτίνες της φωτεινής δέσμης (διαθλώμενες και μη) δεσμεύονται από τον αντικειμενικό φακό για τη δημιουργία ειδώλου Δέσμη φωτός διέρχεται μέσω της οπτικής οδού του μικροσκοπίου η εικόνα φτάνει στο όργανο παρατήρησης (μάτι, camera)

Question 85

Που χρησιμοποιείται και πως επιτυγχάνεται η αντίθεση στη Μικροσκοπία φωτεινού πεδίου (Brightfield microscopy) ;

Answer 85

• Η μικροσκοπία φωτεινού πεδίου χρησιμοποιείται ευρέως για παρατήρηση ιστολογικών τομών (π.χ. βιοψίες) • Για δημιουργία αντίθεσης και παρατήρηση, απαιτείται μονιμοποίηση και χρώση των βιολογικών δειγμάτων (Ιστοχημική ή ανοσο-ιστοχημική)

Question 86

Ποιο είναι το πρόβλημα με την Μικροσκοπία φωτεινού πεδίου | (Brightfield microscopy) ;

Answer 86

Στην πράξη δεν μπορούμε πάντα να έχουμε βαμμένα βιολογικά δείγματα ώστε να τα παρατηρούμε με μικροσκοπία φωτεινού πεδίου: • H χρώση συνήθως απαιτεί μονιμοποίηση του δείγματος συνεπώς δεν είναι δυνατή η παρατήρηση ζωντανών κυττάρων

Question 87

Ποια είναι η διαφορά σκοτεινού υποβάθρου από φωτεινό ;

Answer 87

``` 1. Σε φωτεινό υπόβαθρο το μάτι χρειάζεται διαφορές στην ένταση του φωτός τουλάχιστον 10-20% ώστε να μπορέσει να διακρίνει τα αντικείμενα 2. Σε σκοτεινό υπόβαθρο και με πλάγιο φωτισμό οι λεπτομέρειες των αντικειμένων φαίνονται καθαρότερα ```

Question 88

Τι ονομάζουμε διάθλαση και τι δείκτη διάθλασης ;

Answer 88

Ακτίνα φωτός η οποία προσπίπτει σε κάποιο υλικό, αλλάζει πορεία και διέρχεται μέσα από αυτό. Η γωνία διάθλασης εξαρτάται από το είδος του υλικού (δείκτης διάθλασης, n). n = c/ u c = η σχετική ταχύτητα του κύματος στο κενό και u = η ταχύτητα του κύματος στο υλικό Το γυαλί έχει n = 1.5, δηλαδή το φως ταξιδεύει στο γυαλί με ταχύτητα 1/ 1.5 = 0.66 την ταχύτητα του φωτός στο κενό Εάν ni < nr, τότε θi > θr

Question 89

Πως δημιουργείται αντίθεση στη μικροσκοπία σκοτεινού πεδίου ;

Answer 89

Η μικροσκοπία σκοτεινού πεδίου αξιοποιεί το φαινόμενο της διάθλασης του φωτός το οποίο διέρχεται από το παρασκεύασμα για τη δημιουργία αντίθεσης

Question 90

Πως λειτουργεί η Μικροσκοπία σκοτεινού πεδίου | (Darkfield) ;

Answer 90

• Δημιουργία σκοτεινού υποβάθρου με χρήση κυκλικού διαφράγματος στον πυκνωτή • Ο φακός του πυκνωτή φωτίζει το αντικείμενο με «κούφιο» κώνο φωτός • Μετά την πρόσπτωση στο αντικείμενο, το φως που δεν έχει εκτραπεί (διαθλαστεί) από το αντικείμενο περνά έξω από τον αντικειμενικό φακό • Μόνο φως από διάθλαση (φως που έχει εκτραπεί, πλάγιο) δεσμεύεται από τον αντικειμενικό φακό για τη δημιουργία ειδώλου και το αντικείμενο γίνεται ορατό σε σκοτεινό (μαύρο) φόντο

Question 91

Πως λειτουργεί η Σύγχρονη μικροσκοπία σκοτεινού πεδίου

Answer 91

Τα σύγχρονα μικροσκόπια σκοτεινού πεδίου χρησιμοποιούν μεταβλητό διάφραγμα ίριδας ώστε να αποκλείουν τη διέλευση του φωτός το οποίο δεν έχει εκτραπεί από το αντικείμενο. Ολόκληρος ο κώνος φωτός δεσμεύεται από τον αντικειμενικό φακό αλλά μόνο το φως από διάθλαση χρησιμοποιείται για τη δημιουργία ειδώλου • Τέτοια μικροσκόπια σκοτεινού πεδίου επιτρέπουν τη χρήση αντικειμενικών φακών με μεγάλο αριθμητικό άνοιγμα

Question 92

Ποιες είναι οι εφαρμογές και τα πλεονεκτήματα της Μικροσκοπίας σκοτεινού πεδίου (Darkfield) ;

Answer 92

• Επιτρέπει την ανίχνευση μικρών δομικών λεπτομερειών του παρασκευάσματος χωρίς να χρειάζεται μονιμοποίηση και χρώση αυτού • Μικρά δείγματα όπως λυσοσώματα, μαστίγια βακτηρίων, διάτομα είναι ευκρινώς ορατά με μικροσκοπία σκοτεινού πεδίου • Εύκολη και φτηνή σε σχέση με άλλα είδη μικροσκοπίας τα οποία απαιτούν εξειδικευμένους αντικειμενικούς φακούς (π.χ. αντίθεσης φάσεως και DIC)

Question 93

Ποιοι είναι οι Περιορισμοί της μικροσκοπίας | σκοτεινού πεδίου ;

Answer 93

• Κατά την παρατήρηση με darkfield, τα μεγαλύτερα αντικείμενα εκτρέπουν το φως πιο έντονα από ό,τι τα μικρότερα και έτσι οι λεπτομέρειες των τελευταίων «σκεπάζονται» • Το περίγραμμα των αντικειμένων δεν είναι σαφές • Στις μέρες μας η μικροσκοπία σκοτεινού πεδίου έχει περιορισμένες εφαρμογές και δεν χρησιμοποιείται ευρέως στην Κυτταρική Βιολογία (συνήθως παρατηρούμε τα μη μονιμοποιημένα παρασκευάσματα με phase contrast ή DIC)

Question 94

Ποια είναι η Διαφορά φάσης κυμάτων φωτός ;

Answer 94

• Δύο κύματα με ίδια συχνότητα έχουν διαφορά φάσης αν παρουσιάζουν διαφορετικό πλάτος την ίδια χρονική στιγμή Συχνότητα = ο αριθμός επαναλήψεων στη μονάδα του χρόνου Πλάτος κύματος = η μέγιστη σε ύψος μετατόπιση ενός σημείου, από το σημείο ισορροπίας του κατά τη διέλευση του κύματος • Το κύμα β έχει διαφορά φάσης λ/4 από το κύμα α (Το κύμα β καθυστερεί από το κύμα α κατά λ/4)

Question 95

Ποιες είναι οι Συνέπειες κατά τη διέλευση κυμάτων | φωτός από αντικείμενα ;

Answer 95

Όταν το φως διέρχεται από μη βαμμένα βιολογικά παρασκευάσματα (π.χ κύτταρα) επέρχεται απορρόφηση μέρους αυτού αλλά και αλλαγή της φάσης (επιβράδυνση) του φωτεινού κύματος Όσο πιο παχύ είναι το διαφανές αντικείμενο ή όσο μεγαλύτερος ο δείκτης διάθλασης αυτού, τόσο μεγαλύτερη είναι η επιβράδυνση του φωτεινού κύματος

Question 96

Πως με τη Μικροσκοπία αντίθεσης φάσεως καθίσταται δυνατό να παρατηρούμε κύτταρα ;

Answer 96

•Τα κύτταρα έχουν πάχος 5-10 μm πάνω από τον πυρήνα και μόλις 1 μm πάνω από το κυτταρόπλασμα. Συνεπώς ο πυρήνας απορροφά και επιβραδύνει το διερχόμενο φως διαφορετικά από ό,τι το κυτταρόπλασμα • Η απορρόφηση ορατού φωτός (μείωση του πλάτους της ταλάντωσης) δεν είναι από μόνη της αρκετή ώστε να παρατηρήσουμε τα κύτταρα με ευκολία • Επιπλέον, επέρχεται αλλαγή της φάσης (επιβράδυνση) του διερχόμενου φωτός. Το μάτι δεν αντιλαμβάνεται τη διαφορά φάσης αλλά η μικροσκοπία αντίθεσης φάσεως μετατρέπει τις διαφορές φάσης σε διαφορές έντασης του φωτός οι οποίες γίνονται ορατές από το μάτι • Ταυτόχρονα, το φως που αλληλεπιδρά με το παρασκεύασμα διαθλάται

Question 97

Ποια είναι η πορεία του διαθλώμενου και του μη διαθλώμενου φωτός στη Μικροσκοπία αντίθεσης φάσεως ;

Answer 97

``` • Τόσο το διαθλώμενο όσο και το μη διαθλώμενο από το παρασκεύασμα φως δεσμεύονται από τον αντικειμενικό φακό • Το μη διαθλώμενο φως περνά από ημιδιαφανές phase ring όπου και επιβραδύνεται ενώ ταυτόχρονα απορροφάται περίπου 70% της έντασής του • Το φως από διάθλαση δεν περνά από το phase ring, συνεπώς δεν επιβραδύνεται περεταίρω ούτε μειώνεται περισσότερο η έντασή του ```

Question 98

Ποια είναι η χρησιμότητα και η διαφορά που κάνει η ύπαρξη του phase ring στη Μικροσκοπία αντίθεσης φάσεως ;

Answer 98

• Κατά τη διέλευση από το phase ring, το κύμα υποβάθρου μειώνεται σε ένταση και τροποποιείται η φάση αυτού ώστε να είναι σύγχρονο με το κύμα από το αντικείμενο • Η διαφορά στο πλάτος ταλάντωσης (Α) μεταξύ τελικού (σύνθετου) κύματος, το οποίο προκύπτει από τη συμβολή (σύνθεση) διαθλώμενου και μη διαθλώμενου φωτός, και υποβάθρου είναι μεγαλύτερη με χρήση phase ring από ό,τι χωρίς αυτό • Η διαφορά στην ένταση (I) μεταξύ τελικού (σύνθετου) κύματος και υποβάθρου είναι μεγαλύτερη με χρήση phase ring από ό,τι χωρίς αυτό • Καλύτερη αντίθεση (C) και παρατήρηση αντικειμένου με phase ring

Question 99

Ποιοι είναι οι δύο εναλλακτικοί τρόποι λειτουργίας του phase ring στη Μικροσκοπία αντίθεσης φάσεως ;

Answer 99

2a. Με phase ring Δ=0 Κύτταρα φωτεινότερα από το υπόβαθρο 2b. Με phase ring Δ= 180 μοίρες Κύτταρα πιο σκοτεινά από το υπόβαθρο

Question 100

Εφαρμογές της μικροσκοπίας | αντίθεσης φάσεως (αναφέρετε μία)

Answer 100

• Χρησιμοποιείται για παρατήρηση ζωντανών κυττάρων διεσπαρμένων σε λεπτό υπόστρωμα • Πολύ μεγαλύτερη ευκρίνεια από τη μικροσκοπία darkfield

Question 101

Ποιοί είναι οι περιορισμοί της αντίθεσης φάσεως ;

Answer 101

• Αν και πολύ καλής ποιότητας, η εικόνα με phase contrast δεν είναι τέλεια • Διαταραχές εικόνας (phase artifacts): Στεφάνι (phase halos). Οφείλεται στο ότι στην πράξη, περίπου 25% των διαθλώμενων ακτινών περνά από το phase ring Για αντικείμενα φωτεινότερα του υποβάθρου το στεφάνι είναι σκούρο ενώ για αντικείμενα σκοτεινότερα του υποβάθρου το στεφάνι είναι φωτεινό

Question 102

Τι είναι πολωτής ;

Answer 102

Η διάταξη που παράγει πολωμένο φως ονομάζεται πολωτής (polarizer), αποτελείται από διαφανείς κρυστάλλους ανθρακικού ασβεστίου (CaCO3) και χρησιμοποιείται στη μικροσκοπία πολωμένου φωτός

Question 103

(πόλωση φωτός) τι είναι αναλυτής ;

Answer 103

Ο αναλυτής (analyzer) είναι φίλτρο το οποίο επιτρέπει τη διέλευση κυμάτων πολωμένου φωτός τα οποία ταλαντώνονται κατά το επίπεδο που αυτός ορίζει και απορροφά αυτά τα οποία ταλαντώνονται σε διαφορετικά επίπεδα

Question 104

Γιατί οι κρύσταλοι και τα Βιολογικά παρασκευάσματα τα οποία περιέχουν πολυμερή βιομορίων (ινίδια ακτίνης, κυτταρίνη, κ.ά) αλλάζουν το επίπεδο πόλωσης του πολωμένου φωτός ;

Answer 104

Οι κρύσταλλοι είναι στερεά υλικά των οποίων τα δομικά στοιχεία (άτομα, μόρια ή ιόντα) διατάσσονται με κανονικά επαναλαμβανόμενο τρόπο (συμμετρικά) και στις τρεις διαστάσεις. Ασύμμετρα υλικά = άμορφα Όταν πολωμένο φως διέρχεται από κρυστάλλους ή υλικά με συμμετρία των συστατικών τους μορίων η διεύθυνση ταλάντωσης (το επίπεδο πόλωσης) αυτού αλλάζει

Question 105

Ποιά είναι η αρχή λειτουργίας του μικροσκοπείου πολωμένου φωτός ;

Answer 105

Αρχή της μεθόδου. Πολωμένο φως (μέσω του πολωτή) χρησιμοποιείται για φωτισμό του παρασκευάσματος Μόνο όταν η διεύθυνση ταλάντωσης του πολωμένου φωτός αλλάξει (μετά από διάθλαση σε παρασκεύασμα με εσωτερική συμμετρία) μπορεί φως να περάσει από τον αναλυτή Το δείγμα φαίνεται φωτεινό και το υπόβαθρο μαύρο

Question 106

Ποιές είναι οι εφαρμογές της μικροσκοπίας πολωμένου φωτός ;

Answer 106

• Χρησιμοποιείται για παρατήρηση κρυστάλλων και πολυμερών • Τα βιολογικά παρασκευάσματα περιέχουν πολυμερή ασύμμετρων βιομορίων (ινίδια ακτίνης, κυτταρίνη, κ.ά) • Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για μελέτη δομών σε ζωντανά κύτταρα όπως: Ινιδίων κυτταρίνης στο κυτταρικό τοίχωμα φυτικών κυττάρων και ιικών καψιδίων

Question 107

Ποιές είναι οι Εφαρμογές και περιορισμοί της DIC ;

Answer 107

Παρατήρηση ζωντανών και μη βαμμένων κυττάρων • Εξαιρετική ευκρίνεια και καθαρότητα εικόνας απαλλαγμένη από οπτικά σφάλματα όπως “στεφάνια” (halos) • Απαιτεί διαφανή δείγματα συνεπώς δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τομές ιστών • Χρησιμοποιείται για βιολογικά δείγματα και όχι για παρατήρηση κρυστάλλων ή βιοπολυμερών τα οποία δύνανται να τροποποιήσουν τα επίπεδα πόλωσης των γειτονικών ακτίνων φωτός

Question 108

Περιγράψτε με 7 βήματα την πορεία του φωτός στην DIC μικροσκοπία

Answer 108

1. Για το φωτισμό του δείγματος χρησιμοποιείται πολωμένο φως. 2. Το φως περνά από ένα διπλοθλαστικό πρίσμα του πυκνωτή και χωρίζεται σε δυο ακτίνες που μεταδίδονται παράλληλα με πολύ μικρό διαχωρισμό (συνήθως 0.2 μm) και επίπεδα πόλωσης 0 και 90 μοίρες. 3. Οι ακτίνες αυτές περνούν από γειτονικά σημεία του δείγματος. Εάν τα σημεία αυτά έχουν διαφορετικό πάχος ή δείκτη διάθλασης τότε αλλάζει η φάση τους (το πιο οπτικά πυκνό υλικό επιβραδύνει περισσότερο την ακτίνα φωτός. 4. Τα ζεύγη ακτίνων έχουν τώρα πληροφορία από ζεύγη γειτονικών σημείων με τη μορφή διαφορών φάσης (αόρατες στο μάτι). Τα διαφορετικά επίπεδα πόλωσης εμποδίζουν τη συμβολή (σύνθεση) των δύο κυμάτων τη στιγμή αυτή. 5. Το φως περνά από τον αντικειμενικό φακό και διέρχεται από ένα δεύτερο πρίσμα με αποτέλεσμα οι δύο ακτίνες φωτός να ενώνονται σε μία με επίπεδο πόλωσης 135μοίρες. 6. Αυτό οδηγεί σε συμβολή (σύνθεση) των κυμάτων, μείωση ή αύξηση του πλάτους ταλάντωσης του σύνθετου κύματος στο σημείο εκείνο ανάλογα με τη φάση των επί μέρους κυμάτων και συνεπώς σε σκοτεινότερη ή φωτεινότερη εικόνα. Η σύνθεση είναι όχι μεταξύ δύο ακτίνων που περνούν από το ίδιο σημείο (μικροσκοπία αντίθεσης φάσης) αλλά μεταξύ ακτίνων που περνούν από γειτονικά σημεία. 7. Τέλος το φως περνά από αναλυτή πόλωσης ώστε να αποκλείονται οι μη διαθλασμένες ακτίνες και να έχουμε καλή αντίθεση (μαύρο φόντο)

Question 109

Που χρησιμοποιείται η μικροσκοπία φθορισμού ;

Answer 109

• Εντοπισμός μακρομορίων (πρωτεΐνες, μεταβολίτες, κ.ά.) στο κύτταρο • Παρατήρηση δομών όπως μεμβράνες, κυτταροσκελετός, χρωματίνη, λυσοσσώματα, κ.ά. • Μελέτη της κίνησης μακρομορίων, κυστιδίων και κυττάρων • Μελέτη κυτταρικών λειτουργιών όπως απόπτωση, κυτταρική διαίρεση, ενδοκύτωση, εξωκύτωση, κυτταρική διήθηση, μετάσταση, κ.ά.

Question 110

Ποιες είναι οι κλασσικές τεχνικές μικροσκοπίας φθορισμού ;

Answer 110

» Wide-field fluorescence microscopy (Μικροσκοπία φθορισμού ευρέως πεδίου) »Confocal laser scanning microscopy, CLSM (Συνεστιακή Μικροσκοπία) » 2-photon

Question 111

Ποιές είναι οι εξειδικευμένες τεχνικές μικροσκοπίας φθορισμού ;

Answer 111

» FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) και Photoactivation Τεχνικές Μικροσκοπίας Φθορισμού • Μελέτη πολύ δυναμικών διαδικασιών (διάχυση και κίνηση μακρομορίων) » FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) » FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging) • Μελέτη αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνών » TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence) • Μελέτη δομών του κυτταροσκελετού με μεγάλη ευαισθησία

Question 112

Πως λειτουργεί γενικά η μικροσκοπία φθορισμού ;

Answer 112

``` Μακρομόρια του κυττάρου (πρωτεΐνες, DNA) σημαίνονται με ειδικές φθορίζουσες χρωστικές και παρατηρούνται ως διαφορετικά χρώματα στο μικροσκόπιο φθορισμού Ανάλογα με το είδος του μικροσκόπιου φθορισμού, μπορούμε να παρατηρήσουμε ταυτόχρονα 1, 2 ή 3 φθορίζουσες χρωστικές (χρώματα)!! ```

Question 113

Τι είναι φθορισμός ;

Answer 113

• Άτομα ή μόρια διεγείρονται από ακτινοβολία κατάλληλου μήκους κύματος, δηλαδή απορροφούν ενέργεια με αποτέλεσμα ηλεκτρόνια αυτών να μετακινούνται παροδικά σε υψηλότερη ενεργειακή στοιβάδα. Κατά την επαναφορά των ηλεκτρονίων αυτών στη βασική στοιβάδα εκπέμπεται ακτινοβολία (φθορισμού) μεγαλύτερου μήκους κύματος (μικρότερης ενέργειας, Ε = hc/λ). Ο χρόνος μεταξύ απορρόφησης και εκπομπής κατά το φθορισμό είναι 10-9-10-12 seconds

Question 114

Ποια η διαφορά φάσματος απορόφησης και φασματος εκπομπής ;

Answer 114

• Μόρια τα οποία μπορούν να φθορίζουν ονομάζονται φθορίζοντα μόρια/ ουσίες/ χρωστικές (fluorescent molecules, fluorochromes, fluorescent dyes) • Κάθε φθορίζουσα ουσία έχει χαρακτηριστικά φάσματα απορρόφησης/ εκπομπής ακτινοβολίας τα οποία εξαρτώνται από τη δομή των ατόμων και των ηλεκτρονίων αυτής • Παρατηρείται διαφορά μεταξύ των μέγιστων μηκών κύματος απορρόφησης και εκπομπής (Stokes shift)

Question 115

Τι πρέπει να προσέχουμε στην μικροσκοπία φθορισμού όσο αφορά τα φασματα απορρόφησης και εκπωμπής των ουσιών που χρησιμοποιούμε ;

Answer 115

``` Ακτινοβολία συγκεκριμένου μήκους κύματος δύναται να απορροφηθεί από περισσότερες από μία φθορίζουσες ουσίες και να τις διεγείρει Συχνά υπάρχει επικάλυψη μεταξύ φασμάτων εκπομπής διαφορετικών φθοριζόντων ουσιών Όταν χρησιμοποιούμε περισσότερες από μία φθορίζουσες χρωστικές για να σημάνουμε μακρομόρια, προσπαθούμε να επιλέξουμε συνδυασμούς χρωστικών που έχουν όσο περισσότερο διακριτά φάσματα εκπομπής/ απορρόφησης γίνεται ```

Question 116

Αναφέρετε 3 κοινές φθορίζουσες χρωστικές.

Answer 116

DAPI, FITC-IgG, TRITC

Question 117

Ποιές είναι οι Διατάξεις φωτισμού και φίλτρων | στο μικροσκόπιο φθορισμού ;

Answer 117

a) Φωτεινή πηγή (light source) b) Exciter (excitation) filter c) Dichroic mirror (beamsplitter) d) Emission filter e) Αντικειμενικός φακός υψηλής ποιότητας και NA για μεγιστοποίηση διακριτικού ορίου και αντίθεσης f) Για αποτελεσματική μικροσκόπηση, η φωτεινή πηγή και ο αντικειμενικός φακός ευρίσκονται στην ίδια πλευρά του παρασκευάσματος. Αυτή η διάταξη παροχής φωτός ονομάζεται epiilluminator (αντίθετο: transilluminator) • Ο αντικειμενικός φακός λειτουργεί ως πυκνωτής και διοχετεύει φως στο παρασκεύασμα, αλλά και ως φακός συλλέγοντας από το δείγμα τη φθορίζουσα ακτινοβολία

Question 118

Τι Φωτεινές πηγές χρησιμοποιούνται στη μικροσκοπία φθορισμού ;

Answer 118

``` • Χρησιμοποιούνται φωτεινές πηγές μεγάλης έντασης διότι μόνο ένα στενό φάσμα μηκών κύματος χρησιμοποιούνται για να διεγείρουν το χρωμοφόρο • Συνήθως χρησιμοποιούνται λάμπες Υδραργύρου (Hg) ή Ξένου (Xe) ```

Question 119

Γιατί χρησιμοποιούνται φίλτρα στη μικροσκοπία φθορισμού ;

Answer 119

• Χρησιμοποιούνται για την απομόνωση ακτινοβολιών συγκεκριμένων μηκών κύματος • Προστασία του δείγματος από ακτινοβολία UV και υπέρυθρη από πηγή φωτισμού • Όταν χρησιμοποιούμε περισσότερες της μιας φθορίζουσες χρωστικές μπορεί τα φάσματα απορρόφησης και εκπομπής των χρωστικών να επικαλύπτονται με αποτέλεσμα να πρέπει να τα διαχωρίσουμε

Question 120

Διχροϊκός καθρέπτης (τι κάνει ) ;

Answer 120

``` • Είναι ένα ειδικό long-pass φίλτρο ειδικά σχεδιασμένο ώστε να επιτρέπει τη διέλευση ακτινοβολιών συγκεκριμένων μηκών κύματος και να ανακλά τις υπόλοιπες • Τοποθετείται σε γωνία 45μοίρες ως προς τον οπτικό άξονα του δείγματος και «βλέπει» τη φωτεινή πηγή • Ανακλά το φως διέγερσης (μικρότερου μήκους κύματος) σε γωνία 90μοίρες και το κατευθύνει προς το δείγμα ενώ επιτρέπει τη διέλευση της ακτινοβολίας φθορισμού (μεγαλύτερου μήκους κύματος) η οποία δεσμεύεται από τον αντικειμενικό φακό για τη δημιουργία εικόνας ```

Question 121

Πως λειτουργούν Φίλτρα φωτός για τη φθορίζουσα | χρωστική Fluorescein (FITC) ;

Answer 121

``` • Τα φίλτρα excitation και emission δεν αντιστοιχούν υποχρεωτικά επακριβώς στα excitation και emission μέγιστα της χρωστικής • Τα όρια της διερχόμενης από τα φίλτρα ακτινοβολίας είναι πολύ απότομα • Ο διχροϊκός καθρέπτης ανακλά το 100% της ακτινοβολίας η οποία διεγείρει την FITC, διέλευση (Transmission, T) = 0%, και επιτρέπει τη διέλευση του 80-90% της ακτινοβολίας εκπομπής της FITC (πράσινη) ```

Question 122

Ποιες είναι οι Κλασσικές εφαρμογές | μικροσκοπίας φθορισμού ;

Answer 122

Εντοπισμός μακρομορίων (πρωτεΐνες, DNA) στο κύτταρο • Παρατήρηση κυτταρικών δομών όπως μεμβράνες, κυτταροσκελετός, χρωματίνη, λυσοσσώματα, κ.ά. • Μελέτη κυτταρικών λειτουργιών όπως απόπτωση, κυτταρική διαίρεση, ενδοκύτωση, εξωκύτωση, κυτταρική διήθηση, κ.ά. Κλασσικές

Question 123

Ποιοι είναι δύο διαδεδομένοι τύποι σήμανσης ;

Answer 123

• Για την ανίχνευση των συστατικών του δείγματος που θέλουμε να μελετήσουμε, μπορούν να χρησιμοποιηθούν αντισώματα έναντι αυτών συνδεδεμένα ή σημασμένα με φθορίζοντα μόρια Πέρα από αντισώματα - σημασμένα με φθορίζοντα μόρια, μπορούν να χρησιμοποιηθούν και ορισμένες φθορίζουσες ουσίες οι οποίες προσδένονται απευθείας σε συγκεκριμένα συστατικά του κυττάρου Για παράδειγμα: • DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole). Προσδένεται και σημαίνει το DNA. Excitation max: 350 nm, Emission max: 470 nm (μπλε) • PI (Propidium Iodide). Προσδένεται και σημαίνει το DNA. Excitation max: 536 nm, Emission max: 620-670 nm (κόκκινο) • Phalloidin. Τοξίνη η οποία προσδένεται και σημαίνει ινίδια ακτίνης. Υπάρχουν παραλλαγές αυτής στο εμπόριο για φθορισμό στο πράσινο ή στο κόκκινο μήκος κύματος

Question 124

Μέχρι πόσα περίπου συστατικά του παρασκευάσματος μπορούμε να ανιχνευσουμε με μικροσκοπία φθορισμού ;

Answer 124

• Ανάλογα με τις δυνατότητες του μικροσκοπίου μας (αριθμός φίλτρων, είδος φωτεινής πηγής) μπορούμε να ανιχνεύσουμε ταυτόχρονα ένα, δύο ή τρία συστατικά του παρασκευάσματος, σημαίνοντας αυτά με διαφορετικές φθορίζουσες χρωστικές οι οποίες έχουν διακριτά φάσματα απορρόφησης και εκπομπής

Question 125

Ποιες είναι οι συχνότερες μέθοδοι μονιμοποιήσης ;

Answer 125

1. Paraformaldehyde (PFA) fixation • Fixation σε 3% PFA σε phosphate buffer saline (PBS) • Permeabilisation σε 0.5% Triton σε PBS • Χρώση με κατάλληλα πρωτογενή και δευτερογενή (χρωμοφόρα) αντισώματα 2. Methanol fixation • Fixation σε καθαρή (απόλυτη) Μεθανόλη • Χρώση με κατάλληλα πρωτογενή και δευτερογενή (χρωμοφόρα) αντισώματα

Question 126

Τι γνωρίζετε για την Green Fluorescent Protein (GFP) ;;

Answer 126

• Αποτελείται από 298 αμινοξέα (MW: 26.9 kDa) και φθορίζει πράσινη όταν διεγερθεί από μπλε φως • GFP «φυσικού τύπου»: Μέγιστο διέγερσης στα 395 nm και μέγιστο εκπομπής στα 509 nm • Δεν είναι τοξική για τα κύτταρα και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για παρατήρηση ζωντανών κυττάρων με μικροσκοπία φθορισμού!! • Αποτελείται από 11 β-πτυχωτές επιφάνειες οι οποίες σχηματίζουν δομή βαρελιού • Το χρωμοφόρο μόριο ευρίσκεται εσωτερικά του βαρελιού και προστατεύεται από αλλαγές του pH • Κατά την εκπομπή φθορισμού έχουμε κυκλοποίηση και οξείδωση των αμινοξέων Ser65-Tyr66-Gly67

Question 127

Ποιες πρωτεΐνες είναι μη τοξικές για τα κύτταρα και | χρησιμοποιούνται στη μικροσκοπία φθορισμού ως χρωμοφόρα ;

Answer 127

Η GFP και Μεταλλαγμένα παράγωγα της GFP: • EGFP (enhanced GFP): S56T μετάλλαξη της GFP, πιο διαρκής φθορισμός και μέγιστο διέγερσης στα 488 nm το οποίο ταιριάζει με τα φασματοσκοπικά χαρακτηριστικά των φίλτρων για FITC. Μέγιστο εκπομπής 509 nm • EBFP (enhanced Blue Fluorescent Protein), • ECFP (enhanced Cyan Fluorescent Protein), • EYFP (enhanced Yellow Fluorescent Protein), προέρχονται όλες από σημειακές μεταλλάξεις της EGFP Ds-Red (RFP): Red Fluorescent Protein, απομονώθηκε από τη θαλάσσια ανεμώνη Discosoma coral (Διαφορετική πρωτεΐνη από την GFP) Φθορίζουσες

Question 128

Πως γίνεται ανίχνευση της πρωτεΐνης που μας ενδιαφέρει χωρίς να απαιτείται χρήση αντισώματος ;

Answer 128

Κατασκευάζουμε μια υβριδική πρωτεΐνη στην οποία η GFP έχει κολληθεί (fused) στο Ν- ή στο C-τελικό άκρο της πρωτεΐνης που μελετούμε

Question 129

τι πρέπει να προσέχουμε όταν κανουμε χρώση με GFP υβρυδική πρωτείνη παρόλο που πλέον δεν μας νοιάζει η ειδικότητα κάποιου αντισώματος ;

Answer 129

Είναι σημαντικό να ελέγξουμε ότι η υβριδική πρωτεΐνη | συμπεριφέρεται όμοια με τη πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει

Question 130

αναφέρετε μία Εφαρμογή της πρωτεΐνης GFP

Answer 130

Μπορούμε να σημάνουμε τη χρωματίνη του κυττάρου ώστε να παρατηρούμε αλλαγές στη μορφολογία του DNA σε ζωντανά κύτταρα με την τεχνική της βιντεομικροσκοπίας Παράδειγμα: Κατασκευάζουμε και εκφράζουμε στα κύτταρα μια υβριδική μορφή Ιστόνης με GFP (histone H2B:GFP)

Question 131

Τι είναι και πως λειτουργεί η βιντεομικροσκοπία ;

Answer 131

``` • Inverted μικροσκόπιο φθορισμού (για ζωντανά κύτταρα) • Videocamera φωτογραφίζει το ζωντανό παρασκεύασμα κάθε 1-2 min επί όσες ώρες απαιτείται (Φθορισμός ή/ και DIC/ phase) • Μελέτη κυτταρικών λειτουργιών σε ζωντανά κύτταρα (όπως κυτταρική διαίρεση, απόπτωση, κ.ά.) • Software μπορεί να συμπιέσει τις φωτογραφίες σε video- ταινία ```

Question 132

Ποιο είναι το πλεονέκτημα της συνεστιακής μικροσκοπίας σε σχέση με μικροσκοπία φθορισμού ευρέως πεδίου ;

Answer 132

Φθορίζοντα παρασκευάσματα με σημαντικό πάχος όπως στρογγυλά κύτταρα ή τομές ιστών δεν απεικονίζονται καλά με μικροσκοπία φθορισμού ευρέως πεδίου διότι φθορίζοντα σήματα από μόρια που ευρίσκονται εκτός αλλά κοντά στο επίπεδο εστίασης ανιχνεύονται, αυξάνουν το background και δίνουν εικόνες με χαμηλή αντίθεση (contrast) H συνεστιακή μικροσκοπία (confocal laser scanning microscopy) επιλύει το πρόβλημα διότι απορρίπτει σήματα από κοντινά αντικείμενα πάνω ή κάτω από το επίπεδο εστίασης Με τη συνεστιακή μικροσκοπία παρατηρούμε οπτικές «τομές» του παρασκευάσματος!!

Question 133

Ποιά είναι τα Βασικά στοιχεία του συνεστιακού | μικροσκοπίου (Confocal) ;

Answer 133

Αποτελείται από μικροσκόπιο φθορισμού, πολλαπλές πηγές φωτός laser, την κεφαλή σάρωσης (scan head) με οπτικά και ηλεκτρονικά στοιχεία, ηλεκτρονικό υπολογιστή, software και οθόνες για συλλογή, επεξεργασία και ανάλυση της εικόνας

Question 134

Πως λειτουργεί το Confocal ;

Answer 134

Το laser παρέχει τη φωτεινή δέσμη η οποία υπό τον έλεγχο ηλεκτρονικού υπολογιστή «σαρώνει» το παρασκεύασμα. Η κεφαλή σάρωσης του confocal κατευθύνει τα φθορίζοντα σήματα από το παρασκεύασμα στην pinhole και τον φωτοπολλαπλασιαστή (photomultiplier, PMT). Ο ηλεκτρονικός υπολογιστής μετατρέπει τις διαφορές έντασης φωτός σε ψηφιακή εικόνα. Η εικόνα του confocal δεν δημιουργείται στο μικροσκόπιο και μπορούμε να τη δούμε μόνο στην οθόνη του ηλεκτρονικού υπολογιστή.

Question 135

από τι αποτελείται η οπτική διάταξη του confocal | scan head ;

Answer 135

``` • Διάταξη εισαγωγής φωτός laser • Φίλτρα φθορισμού • Μηχανισμός σάρωσης (scanning) του παρασκευάσματος • Διάφραγμα Pinhole • Φωτοπολλαπλασιαστής (PMT) ```

Question 136

Πως λειτουργεί η οπτική διάταξη του confocal | scan head ;

Answer 136

``` • Epi-illumination • H δέσμη laser επικεντρώνεται σε ένα σημείο του παρασκευάσματος και σαρώνει το επίπεδο εστίασης από δεξιά προς τα αριστερά και από επάνω προς τα κάτω • Η pinhole ευρίσκεται στο επίπεδο σχηματισμού του ειδώλου. Δέχεται τα φωτόνια φθορισμού από το σημείο του παρασκευάσματος το οποίο σαρώνει η δέσμη laser και αποκλείει το φθορισμό από σημεία εκτός του επιπέδου εστίασης • Ο PMT δέχεται συνεχή ροή φωτονίων η οποία μετατρέπεται σε αλλαγές ηλεκτρικής τάσεως • Ο ηλεκτρονικός υπολογιστής μετατρέπει τις αλλαγές τάσεως σε ψηφιακό φωτεινό σήμα στην οθόνη ```

Question 137

Πως λειτουργεί ο μηχανισμός ελέγχου σάρωσης | του CLSM ;

Answer 137

``` • Ο μηχανισμός περιλαμβάνει δύο καθρέπτες στο εσωτερικό του confocal scan head (στο σχήμα φαίνεται ο ένας) οι οποίοι ταλαντώνονται σε διευθύνσεις κάθετες μεταξύ τους • Ο ένας καθρέπτης ελέγχει τη σάρωση του παρασκευάσματος κατά τον άξονα χ και ο άλλος κατά τον άξονα ψ • Η ταχύτητα σάρωσης και η έκταση της περιοχής που σαρώνεται ελέγχονται από τον χρήστη ```

Question 138

Ποια είναι η λειτουργία της pinhole ;

Answer 138

• Φθορίζουσα ακτινοβολία η οποία εκπέμπεται από σημείο του παρασκευάσματος στο επίπεδο εστίασης (σάρωσης), σχηματίζει στο διάφραγμα της pinhole μικρό φωτεινό σημείο • Φθορίζουσα ακτινοβολία η οποία εκπέμπεται από σημεία του παρασκευάσματος πάνω ή κάτω από το επίπεδο εστίασης (σάρωσης) σχηματίζει στο διάφραγμα της pinhole φωτεινό δίσκο • Μόνο ελάχιστο ποσοστό ακτινοβολίας από θέσεις εκτός επιπέδου εστίασης συλλέγεται από τον ανιχνευτή PMT, έτσι επιτυγχάνεται καλύτερη παρατήρηση λεπτομερειών του παρασκευάσματος από ό,τι με μικροσκοπία φθορισμού ευρέως πεδίου

Question 139

τι κάνει το Deconvolution software στο confocal ;

Answer 139

• Αφού γίνει Διαδοχική σάρωση του παρασκευάσματος σε πολλαπλά επίπεδα (οπτικές τομές) με προκαθορισμένη απόσταση (step) μεταξύ τους κατά τον άξονα z • Deconvolution software: Προβολή των οπτικών τομών σε ένα επίπεδο ή τρισδιάστατη αναπαράσταση

Question 140

Κριτήρια για την ποιότητα της εικόνας συστήματος συνεστιακής μικροσκοπίας ;

Answer 140

* Διακριτικό όριο * Ένταση φωτεινού σήματος * Λόγος σήματος προς θόρυβο

Question 141

Πως γίνεται η Ρύθμιση της ποιότητας της εικόνας | κατά τη συνεστιακή μικροσκοπία ;

Answer 141

``` • Αριθμητικό άνοιγμα, μεγέθυνση και διόρθωση σφαλμάτων από τον αντικειμενικό φακό • Ρυθμίσεις offset και gain του PMT • Ρυθμίσεις pinhole • Ταχύτητα σάρωσης • Zoom εικόνας ```

Question 142

Τι είναι οι Ρυθμίσεις offset και gain από τον | αναλυτή PMT ;

Answer 142

Οι ρυθμίσεις gain και offset (αντιστάθμιση) γίνονται ηλεκτρονικά από τον χρήστη και βελτιώνουν το λόγο: σήμα/ θόρυβος Το offset καθορίζει το κατώφλι ανίχνευσης φωτός από τον PMT Το gain αυξάνει το σήμα πολλαπλασιάζοντας την τάση που βγαίνει από τον PMT επί ένα σταθερό συντελεστή πριν αυτή μετατραπεί σε ψηφιακό σήμα. Το gain ρυθμίζεται μετά από το offset

Question 143

Τι κάνει η ρύθμιση της pinhole ;

Answer 143

``` Μεγαλύτερη pinhole = παρατήρηση πιο παχιάς «τομής» του παρασκευάσματος Μεγαλύτερη pinhole = μεγαλύτερη ένταση σήματος φθορισμού • Μεγαλύτερη pinhole = μικρότερη διακριτική ικανότητα λόγω πρόσληψης φθορίζουσας ακτινοβολίας από σημεία εκτός του επιπέδου εστίασης • Η ρύθμιση του μεγέθους της pinhole γίνεται ηλεκτρονικά ```

Question 144

Τι κάνει η Ρύθμιση της ταχύτητας σάρωσης | του παρασκευάσματος ;

Answer 144

``` Μικρότερη ταχύτητα σάρωσης = καθυστερεί η δέσμη laser περισσότερο χρόνο σε κάθε σημείο του παρασκευάσματος (ρύθμιση ταχύτητας ηλεκτρονικά) • Μικρότερη ταχύτητα σάρωσης = μεγαλύτερη ένταση σήματος • Μικρότερη ταχύτητα σάρωσης = πιο γρήγορη εξασθένηση του σήματος από τη συνεχή έκθεση του χρωμοφόρου σε ακτίνα laser υψηλής εντάσεως (photobleaching) ```

Question 145

τι κάνει η Ρύθμιση του zoom της εικόνας ;

Answer 145

• Αυξάνοντας το ηλεκτρονικό zoom της εικόνας (ρύθμιση ηλεκτρονικά) η δέσμη laser σαρώνει μικρότερη περιοχή του παρασκευάσματος • Επειδή η zoomed εικόνα έχει ίδιο αριθμό pixels, η εικόνα εμφανίζεται μεγεθυμένη στην οθόνη • Το πόσο «ωφέλιμη» είναι η μεγέθυνση (zoom) εξαρτάται από το αριθμητικό άνοιγμα του φακο

Question 146

Ποια είναι τα Πλεονεκτήματα της συνεστιακής μικροσκοπίας σε σύγκριση με τη μικροσκοπία φθορισμού ευρέως πεδίου ;

Answer 146

• Μπορούμε να δούμε με ευκρίνεια οπτικές τομές σε παρασκευάσματα με πάχος 10-80 μm (π.χ. ιστολογικές τομές) • Καλύτερη ευκρίνεια εικόνας ακόμα και σε λεπτά παρασκευάσματα (π.χ. λεπτή στρώση κυττάρων) • Παίρνοντας «στοίβα» τομών κατά τον κατακόρυφο άξονα (zstacks) μπορούμε να επιτύχουμε προβολή των οπτικών τομών σε ένα επίπεδο, τρισδιάστατη απεικόνιση, περιστροφή, εγκάρσια όψη του παρασκευάσματος, κ.ά.

Question 147

Ποιες είναι οι πιο Συνηθισμένες εφαρμογές της | συνεστιακής μικροσκοπίας ;

Answer 147

Παρατήρηση φθοριζόντων βιολογικών δομών • Λεπτομερής παρατήρηση ενδοκυτταρικών δομών όπως μεμβράνες, κυτταροσκελετός, χρωματίνη, λυσοσσώματα, κ.ά. • Ακριβής εντοπισμός μακρομορίων στο κύτταρο • Συνεντοπισμός μακρομορίων (π.χ. πρωτεϊνών) στο κύτταρο • Παρατήρηση μονιμοποιημένων δειγμάτων • Παρατήρηση ζωντανών κυττάρων με βιντεομικροσκοπία (GFP-σημασμένα μακρομόρια)

Question 148

2-photon microscopy, Αρχή λειτουργίας ;

Answer 148

Η ίδια ενέργεια διέγερσης Ε μπορεί να επιτευχθεί με δύο φωτόνια, κάθε ένα από τα οποία έχει τη μισή συχνότητα (ή το διπλάσιο μήκος κύματος) ενός φωτονίου διέγερσης, Ε = h (v/2 + v/2)

Question 149

Ποια είναι τα Χαρακτηριστικά της 2-photon | microscopy ;

Answer 149

Χρησιμοποιούνται ακτινοβολίες μεγαλύτερου μήκους κύματος (στο υπέρυθρο) και άρα μικρότερης ενέργειας από τα άλλα είδη μικροσκοπίας φθορισμού 􀂙 H δέσμη laser πρέπει να είναι πολύ στενά εστιασμένη διότι με μια πιο διάχυτη δέσμη η πιθανότητα το ίδιο χρωμοφόρο να δεσμεύσει δεύτερο φωτόνιο όσον χρόνο είναι διεγερμένο από το πρώτο, είναι αμελητέα 􀂙 Διέγερση με 2 φωτόνια συμβαίνει μόνο στο επίπεδο εστίασης, άρα δεν χρειάζεται pinhole

Question 150

Αναφέρετε Πλεονεκτήματα της 2-photon ως | προς την confocal microscopy

Answer 150

• Σε λεπτά δείγματα (10- 50 μm), για παράδειγμα λίγες στρώσεις κυττάρων, η ευκρίνεια και των δύο μεθόδων είναι παρόμοια. Όμως το photobleaching φθοριζόντων μορίων πάνω και κάτω από το επίπεδο εστίασης είναι πολύ μικρότερο στη 2-photon • Η υπέρυθρη ακτινοβολία διαπερνά μεγαλύτερο πάχος παρασκευάσματος από αυτήν μεγαλύτερης συχνότητας • Είναι λιγότερο φωτοτοξική λόγω μικρότερης ενέργειας Η 2-photon χρησιμοποιείται για απεικόνιση παχέων ιστών (deep tissue imaging) βάθους έως 1 mm σε ζωντανούς οργανισμούς (in vivo imaging)

Question 151

Παραδείγματα εφαρμογών της 2- | photon microscopy ;

Answer 151

• Παρατήρηση ζωντανών εμβρύων Έμβρυα ποντικού βάφτηκαν με μη τοξική φθορίζουσα χρωστική η οποία δεσμεύεται στα μιτοχόνδρια και μελετήθηκαν σε πειράματα κυτταροκαλλιέργειας Με παρατήρηση με confocal microscopy η ανάπτυξη του εμβρύου σταμάτησε μετά από λίγα λεπτά Με 2-photon-microscopy τα έμβρυα επέζησαν και η ανάπτυξή τους μελετήθηκε επί 2 περίπου ημέρες

Question 152

Τι μετρούν τα FRET και FLIM ;

Answer 152

Μετρούν την ικανότητα βιομορίων (συνήθως πρωτεϊνών) να αλληλεπιδρούν κάτω από διάφορες συνθήκες FRET και FLIM

Question 153

Πως ελεγχουμε αν Αλληλεπιδρούν οι | πρωτεΐνες Α και Β ;

Answer 153

Βιοχημικές μέθοδοι (ανοσοκατακρήμνιση) Ο συνεντοπισμός (colocalisation) δύο πρωτεϊνών είναι μια καλή ένδειξη για αλληλεπίδραση αυτών Μελέτη συνεντοπισμού πρωτεϊνών με συνεστιακή μικροσκοπία: • Σήμανση των πρωτεϊνών με φθορίζουσες χρωστικές • Παρατήρηση

Question 154

Πως καταλαβαίνουμε στην συνεστιακή μικροσκοπία αν δυο πρωτείνες βρίσκονται κοντά ( αλληλεπιδρούν) ;

Answer 154

``` protein-A:FITC (πράσινο) protein-B:TRITC (κόκκινο) Οι πρωτεΐνες A και B συνεντοπίζονται (κίτρινο) (εγγύτητα 50-100 nm) Αυτή είναι μια καλή ένδειξη για αλληλεπίδραση των δύο πρωτεϊνών ```

Question 155

Τι είναι και τι ανιχνέυει η FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) ;

Answer 155

• Μέθοδος για περαιτέρω διερεύνηση μοριακών αλληλεπιδράσεων φθοριζόντων μορίων (συνήθως πρωτεϊνών) • Ανιχνεύει εγγύτητα μορίων περίπου 1-10 nm (Εκπέμπεται φθορισμός από μεταφορά ενέργειας μεταξύ φθοριζόντων μορίων - FRET)

Question 156

Ποια είναι η αρχή λειτουργίας της FRET ;

Answer 156

• Αρχή της μεθόδου: Ο χρήστης διεγείρει το μόριο δότη ενέργειας το οποίο εκπέμπει φθορισμό μικρότερου μήκους κύματος (π.χ πράσινο) και ανιχνεύει φθορισμό από το μόριο δέκτη ενέργειας, το οποίο εκπέμπει σε μεγαλύτερο μήκος κύματος (π.χ. κόκκινο) • Εάν τα φθορίζοντα μόρια είναι πολύ κοντά μεταξύ τους ώστε να αλληλεπιδρούν, μέρος της ενέργειας εκπομπής του δότη απορροφάται από το μόριο-δέκτη και προκαλεί φθορισμό του τελευταίου

Question 157

Τι ονομάζουμε Κατάσταση FRET ;

Answer 157

Διέγερση του δότη (FITC) αλλά ανίχνευση εκπομπής μόνο του δέκτη (TRITC) Αν δεν ανιχνεύεται (TRITC) φθορισμός στα 620 nm (κόκκινο) τότε έχουμε ΝΟ FRET

Question 158

Το FRET ή το FLIM μπορεί να χρησιμοποιηθεί και σε ζωντανά κύτταρα ;

Answer 158

Χρησιμοποιείται για τη διερεύνηση μοριακών αλληλεπιδράσεων | πρωτεϊνών (1-10 nm) σε ζωντανά ή μονιμοποιημένα κύτταρα

Question 159

Τι είδους χρωστική απαιτείται για να λειτουργήσει η τεχνική FRET ;

Answer 159

``` Κατάλληλο ζευγάρι φθοριζουσών χρωστικών για FRET • Επικάλυψη μεταξύ φάσματος εκπομπής δότη (Donor) και φάσματος απορρόφησης δέκτη (Acceptor) • Διακριτά φάσματα εκπομπής δότη και δέκτη ```

Question 160

Ποια είναι τα Συνηθισμένα Προβλήματα της FRET ;

Answer 160

• Η ένταση του σήματος FRET εξαρτάται όχι μόνο από την αλληλεπίδραση μεταξύ δότη και δέκτη, αλλά και τη συγκέντρωση των μορίων του δέκτη • Εάν χρησιμοποιείται ως δέκτης φθορίζον αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης, η ένταση του σήματος FRET εξαρτάται από τη συγκέντρωση του αντισώματος και την ικανότητα αυτού να αναγνωρίζει τον αντίστοιχο επίτοπο της πρωτεΐνης

Question 161

Σε τι μικροσκόπιο κάνουμε FRET, FLIM ;

Answer 161

confocal με το | κατάλληλο software

Question 162

Τι μετράει η τεχνική FLIM και από τι επηρεάζεται αυτό ;

Answer 162

``` • Μετράει το χρόνο ζωής (lifetime) της διεγερμένης κατάστασης του φθορίζοντος μορίου δότη • Κάθε μόριο έχει ιδιαίτερο χρόνο ζωής της διεγερμένης κατάστασης • Αυτός ο χρόνος μπορεί να μεταβληθεί από το τοπικό περιβάλλον: 􀀹 Συγκεντρώσεις ιόντων 􀀹 Συγκέντρωση οξυγόνου 􀀹 pH 􀀹 Αλληλεπιδράσεις (FRET) με άλλα φθορίζοντα μόρια ``` NO FRET = Δt1 FRET = Δt2 (< Δt1)

Question 163

Ποια είναι η σημαντική διαφορά του FLIM από το FRET ;

Answer 163

Εξακολουθεί να απαιτείται: Κατάλληλο ζευγάρι φθοριζόντων χρωστικών για FRET Όμως: • Δεν επηρεάζεται η μέτρηση από τη συγκέντρωση των φθοριζόντων μορίων του δέκτη ή την ποιότητα του αντισώματος έναντι του δέκτη

Question 164

Τι είναι οι FRAP και Photoactivation, που χρησιμοποιούνται και με τι μικροσκόπιο ;

Answer 164

• Μετρούν την ικανότητα βιομορίων (πρωτεΐνες, λιπίδια, υδατάνθρακες) να μετακινούνται κάτω από διάφορες συνθήκες • Μελέτη δυναμικών κυτταρικών διεργασιών όπως μεταφορά μορίων από μεμβράνες, αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, κυτταρική κίνηση, κ.ά. • Ζωντανά κύτταρα • Ομοιοπολική πρόσδεση ή υβρίδια (fusion) των βιομορίων που θέλουμε να μελετήσουμε με φθορίζοντα μόρια • Χρησιμοποιείται point-detection/scanning μικροσκόπιο confocal

Question 165

Αρχή λειτουργίας FRAP (Fluorescence Recovery After | Photobleaching) ;

Answer 165

Οι φθορίζουσες χρωστικές διεγείρονται από φως κατάλληλης συχνότητας και εκπέμπουν ακτινοβολία φθορισμού Εάν η ακτινοβολία διέγερσης είναι μεγάλης έντασης, η φθορίζουσα χρωστική θα «ξεβάψει» πολύ γρήγορα (photobleaching) και δεν θα μπορεί να εκπέμψει ακτινοβολία φθορισμού από εκεί και πέρα Στην FRAP μετράμε πόσο γρήγορα αυτή η περιοχή με τα «ξεβαμμένα» μόρια θα αρχίσει να φθορίζει και πάλι λόγω κίνησης φθοριζόντων μορίων από γειτονικές περιοχές

Question 166

Τι ακριβώς μετράμε στο FRAP ;

Answer 166

``` Καθώς ο φθορισμός επανέρχεται στη φθορίζουσα περιοχή προσδιορίζονται δύο παράμετροι: • Πόσος φθορισμός επανακτάται μετά το photobleaching (Recovery = Υ/ Χ 100%) B. Πόσο γρήγορα γίνεται η επανάκτηση (κλίση της καμπύλης 3) Όσο πιο ταχεία και πλήρης η επανάκτηση του φθορισμού τόσο πιο γρήγορη και ελεύθερη η κίνηση των μορίων ```

Question 167

Ομοιότητες Photoactivation (PA) με FRAP ;

Answer 167

• Όπως και η FRAP, μετράει την ικανότητα βιομορίων (πρωτεΐνες, λιπίδια, υδατάνθρακες) να μετακινούνται κάτω από διάφορες συνθήκες • Εφαρμόζεται σε ζωντανά κύτταρα • Χρησιμοποιείται point-detection/scanning μικροσκόπιο confocal

Question 168

Με τι σημαίνονται τα μόρια που μελετά η Photoactivation (PA) ;

Answer 168

Τα βιομόρια που μελετούμε σημαίνονται με φθορίζουσες ουσίες- παράγωγα της GFP (photoactivated GFP, PA-GFP) τα οποία εκπέμπουν έως 100 φορές πιο έντονα από την «απλή» GFP

Question 169

Αρχή λειτουργίας Photoactivation (PA) ;

Answer 169

Όσο πιο ταχεία και πλήρης η μείωση του φθορισμού τόσο πιο γρήγορη και ελεύθερη η κίνηση των μορίων.

Question 170

TIRF (Total Internal Reflection | Fluorescence) Τι είναι και πως λειτουργεί ;

Answer 170

• Τεχνική η οποία επιτρέπει εξαιρετικά λεπτές οπτικές τομές στην επιφάνεια επαφής των κυττάρων με το γυάλινο υπόστρωμα πάνω στο οποίο μεγαλώνουν • Χρησιμοποιείται κυρίως σε ζωντανά κύτταρα για μελέτη λειτουργιών της κυτταρικής μεμβράνης, παρατήρηση της δυναμικής του κυτταροσκελετού, μελέτη της διακίνησης πρωτεϊνών και κυστιδίων, της κυτταρικής πρόσδεσης και κίνησης, κ.ά. • Πρωτεΐνες προς παρατήρηση υβριδικές (fused) με παράγωγα της GFP • H TIRF ονομάζεται έτσι διότι απαιτεί ολική ανάκλαση της ακτινοβολίας διέγερσης

Question 171

Πως λαμβάνεται η εικόνα φθορισμού στην TIRF ;

Answer 171

• Η ακτινοβολία διέγερσης πρέπει να πέσει στη διαχωριστική επιφάνεια γυαλιού-υδάτινου μέσου με συγκεκριμένη γωνία ώστε να ανακλαστεί ολόκληρη • Στην επιφάνεια αυτή δημιουργείται λεπτή ζώνη (~100 nm) παροδικής φθορίζουσας ακτινοβολίας (evanescent wave region) • To παροδικό ηλεκτρομαγνητικό κύμα χρησιμοποιείται για τη δημιουργία εικόνας φθορισμού

Question 172

Πλεονεκτήματα της μεθόδου TIRF ;

Answer 172

• Επειδή η παροδική ακτινοβολία προέρχεται από λεπτή περιοχή του κυττάρου (~100 nm), το background είναι πολύ μικρότερο σε σχέση π.χ. με τη μικροσκοπία confocal (πάχος οπτικής τομής ~500 nm) και ασθενικά φθορίζοντα σήματα γίνονται ορατά με μεγαλύτερη ευκρίνεια • Επειδή η παροδική ακτινοβολία δημιουργείται στην οριακή ζώνη κυττάρου- γυάλινου slide, είναι κατάλληλη για μελέτη της κυτταρικής μεμβράνης (πάχους ~ 15 nm) και της κοντινής σε αυτήν περιοχής του κυτταροπλάσματος

Question 173

Σε τι μικροσκόπιο γίνεται η TIRF ;

Answer 173

• Για TIRF απαιτείται ειδικό μικροσκόπιο φθορισμού wide-field με αντικειμενικούς φακούς μεγάλου ΝΑ και πυκνωτή με ρυθμιζόμενη γωνία πρόσπτωσης του φωτός