Module 10 - Électrophorèse de protéines Flashcards
(33 cards)
Pour quels composés est utilisé le gel de polyacrylamide?
Pour les acides nucléiques de petite taille et les protéines.
Vrai ou Faux. Le gel de polyacrylamide est chargé positivement.
Faux. Le gel est non chargé et inerte.
Comment peut-on former un gel poreux qui pourra être utilisé lors de l’électrophorèse?
En faisant la polymérisation de l’acrylamide seul avec le bis-acrylamide, un agent réticulant.
Quelle est la relation entre le % d’acrylamide dans le gel et la distance de migration d’une protéine?
Plus le % d’acrylamide est élevé, moins la protéine migre loin. Un % d’acrylamide élevé forme plus de pores, donc nuit davantage à la migration des protéines.
De quoi dépend la taille des pores dans un gel de polyacrylamide?
1) Du % total d’acrylamide et de bis-acrylamide
2) De la proportion acrylamide/bis-acrylamide
Quelle modification pourrait-on faire dans un protocole pour qu’une protéine migre davantage dans le gel/soit plus au centre?
Diminuer la concentration de polyacrylamide du gel
Quel composé est nécessaire pour initier la polymérisation de l’acrylamide?
Le persulfate d’ammonium, lequel fournit des radicaux libres au mélange d’acrylamide qui sont nécessaires à la polymérisation…
Quel composé est rajouté au mélange d’acrylamide pour accélérer la réaction de polymérisation?
Le TEMED
Quel réactif inhibe la réaction de polymérisation d’un gel de polyacrylamide?
L’oxygène
Qu’est-ce que l’électrophorèse en conditions natives?
C’est l’électrophorèse en conditions non-dénaturantes, donc les protéines conservent leur structure 3D.
De quoi dépend la séparation des protéines lors de l’électrophorèse en conditions natives?
1) Charge nette
2) Structure (forme)
3) Taille (poids moléculaire)
Pour quels types d’étude serait-il préférable de faire l’électrophorèse en conditions natives?
Pour des études où la structure de la protéine doit être conservée, donc des études structurales, fonctionnelles ou enzymatiques.
Lorsque le pH est inférieur au pI d’une protéine, quelle est la charge de cette protéine (+ ou -)?
Positive (+)
Lorsque le pH est supérieur au pI d’une protéine, quelle est la charge de cette protéine (+ ou -)?
Négative (-)
Comment pourrait-on déterminer le pI d’une protéine. Quel type d’électrophorèse devrait être utilisé?
On utilise l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions non-dénaturantes pour séparer les protéines selon leur charge.
Le gel de polyacrylamide utilisé pour ce type d’électrophorèse contient un gradient de pH (une extrémité du gel est basique tandis que l’autre est acide). Le pH diminue graduellement le long du gel.
À pH très basique, les protéines portent toutes des charges nettes négatives; elles migrent donc vers l’électrode positive. À mesure qu’elles migrent dans le gel, il y a modification de leur charge nette, car le pH du gel change. Lorsqu’une protéine se retrouve dans une zone correspondant à son pI, elle ne porte plus de charge nette. Par conséquent, elle n’est plus entraînée par le champ électrique et il y a arrêt de sa migration.
Qu’est-ce que l’électrophorèse en conditions dénaturantes?
C’est l’électrophorèse avec l’ajout d’un détergent anionique, le SDS.
Quelles sont les propriétés du SDS?
Le SDS est un détergent qui:
1) Brise les interactions non covalentes (ex: liens H) dans les protéines (dénature les protéines)
2) Uniformise la forme et la densité de charge des protéines
De quoi dépend la séparation des protéines lors de l’électrophorèse SDS-PAGE (conditions dénaturantes)?
De la masse moléculaire uniquement!!!
Les molécules de SDS sont chargées négativement. Le nombre de molécules de SDS qui se lient à une protéine est proportionnel à la taille de celle-ci. La méthode SDS-PAGE permet donc d’uniformiser le ratio charge/masse des protéines et de les séparer selon leur masse moléculaire uniquement.
Quels sont les paramètres que l’on peut déterminer avec l’électrophorèse SDS-PAGE?
1) La masse moléculaire apparente des protéines
2) Le nombre de sous-unités d’une protéine
3) La pureté d’un échantillon suite à un procédé de purification
Quelle est la différence entre la dégradation et la dénaturation d’une protéine?
Dégradation: perte de la structure primaire par des protéases, irréversible
Dénaturation: perte des structures tertiaire et quaternaire par des changements de température, de pH ou l’ajout de détergents (SDS), réversible
Quel est le rôle du β-mercaptoéthanol dans l’électrophorèse SDS-PAGE?
Le β-mercaptoéthanol est un agent réducteur qui détruit les ponts disulfures formés entre les résidus Cys en présence de chaleur.
Pourquoi a-t-on besoin de compléter la dénaturation des protéines avec de la chaleur et un pH acide?
Pour être certain que la dénaturation est complète et pour déplier et linéariser les molécules.
En quoi consiste le SDS-PAGE en système discontinu?
En la séparation de deux gels de polyacrylamide:
1) Gel de concentration/d’empilement (2-4%)
2) Gel de résolution/séparation (7-15%)
On utilise deux tampons de pH différents, ce qui permet de concentrer les échantillons en une fine bande pour une meilleure résolution.
De quoi est habituellement composé le gel d’empilement et quel est son pH?
De tampon TRIS-HCl à pH 6,8.
