Observations Microscopiques

Question 1

Quelle lumière utilise le microscope optique/photonique

Answer 1

Lumière visible

Question 2

Qu’utilise les microscopes électroniques

Answer 2

Des électrons

Question 3

Rôle de la lentille dans le microscope optique

Answer 3

La lentille focalise les rayons lumineux vers le foyer en utilisant la réfraction de là lumières

Question 4

Formule de l’agrandissement du microscope optique

Answer 4

Objectif x oculaire

Question 5

Agrandissement maximum du microscope optique

Answer 5

3000x

Question 6

Formule de la limite de résolution

Answer 6

LR= longueur d’onde / (2x indice de réfraction du milieuxsin•)

Question 7

Def limite de résolution

Answer 7

Distance minimale entre 2 points qui peuvent être perçus en étant distincts

Question 8

Comment diminuer la limite de résolution et augmenter la résolution ?

Answer 8

• on ne peut pas changé sin• car il est constant
• on peut diminuer la longueur d’onde MAIS les UV ne peuvent pas passer dans le condensateur en verre + UV dangereux pour les yeux + il faut transformer les UV transmis dans la lumière visible
• augmenter l’indice de réfraction du milieu: on utilise de l’huile à immersion pour limiter les vaisseaux lumineux

Question 9

Que les sont les diff types de microscopes optiques ?

Answer 9

• microscope a fond clair
• microscope a fond noir
• microscope a contraste de phase
• microscope a contraste d’interférence différentielle
• microscope a (épi)fluorescence
  -microscope confocal à balayage laser

Question 10

Caractéristiques du microscope

Answer 10

Présence d’un condensateur, objectif et oculaire

Question 11

Rôle du condensateur

Answer 11

Moduler les faisceaux de lumière sur l’échantillon

Question 12

Rôle de l’oculaire

Answer 12

Permet d’observer l’échantillon et produit un grossissement initial

Question 13

Rôle de l’objectif

Answer 13

Permet d’agrandir l’image

Question 14

Définition de contraste

Answer 14

Capacité à distinguer une structure de son environnement

Question 15

Caractéristiques de microscope a fond clair

Answer 15

L’échantillon est placé directement sur la lamelle: préparation a l’état frais
Utiliser pour des microorganismes de grandes taille.
Les cellules sont vivantes, on peut observer leur morphologie, leur motilité, leur division

Question 16

Limite du microscope a fond clair

Answer 16

Les cellules vivantes ne sont pas clairement visibles car le contraste entre l’eau et les structures cellulaires est faible

Question 17

Comment augmenter le contraste ?

Answer 17

Utiliser des colorants qui exigent fixation, séchage
Les cellules ne sont donc plus vivantes et peuvent être altérées

Question 18

Caractéristiques et exemples des colorants

Answer 18

Molécules chargées ou hydrophobes qui adhèrent à la cellule
Ex: coloration uniforme (1 seule couleur) -> bleu de méthylène
Coloration différentielle (différentes couleurs pour différentes structures-> coloration gram’+/-
Coloration alcoolo-acido-resistante -> permet de savoir si l’échantillon contient des mycobacteries

Question 19

Quel type d’observation avec une coloration différentielle ?

Answer 19

On veut DIFFÉRENCIER certaines cellules/bactéries par leur caractéristique:
- présence d’endospores
-présence de capsule
-présence de flagelles
- présence de corps d’inclusion (réserves à l’intérieur du cytoplasme

Question 20

Caractéristiques du microscope a fond noir

Answer 20

Un écran est placé sous le condensateur à lentille convergente. Le condensateur produit un cône creux de lumière.
La seule lumière qui entre dans l’objectif provient de l’échantillon
On observe des structures lumineuses sur fond noir
Les cellules sont vivantes

Question 21

Caractéristiques du microscope a contraste de phase

Answer 21

Un anneau de phase sur le condensateur concentre la lumière sur l’échantillon. La lumière déviée par l’échantillon est déphasée et celle qui passe à côté(non déviée) passent à travers l’objectif vers la lame de phase qui met en phase. Le microscope change ces différences de phases en différences d’intensité lumineuse. On observe des images sombres sur fond clair avec un halo lumineux auteurs de l’échantillon. On peut voir des structures plus fines et les cellules sont vivantes

Question 22

Caractéristiques du microscope a contraste d’interférence différentielle

Answer 22

Détecte les différences d’indice de réfraction et d’épaisseur. Des prismes génèrent 2 rayons de lumière polarisée: 1 rayon passe dans l’échantillon (modification dès la polarisation) et l’autre passe dans une zone claire. Les 2 rayons sont récombinés. Le microscope traduit ces différences de polarisation par une différence d’intensité lumineuse.
Au niveau du condensateur il y a des lentilles polarisantes.
Coloration vive et pseudo relief
Observation de cellules vivantes

Question 23

Caractéristiques du microscope a epi(fluorescence)

Answer 23

Une lampe à mercure produit une lumière UV qui est dirigé vers l’objectif par un miroir dichromatique et qui excite un échantillon (dans l’épi fluorescence l’échantillon est illuminé par le haut plutôt que par le bas) traite avec des fluorochromes. Ces fluorochromes émettent une lumière visible.
L’objectif doit être en quartz pour les UV.

Question 24

Buts et utilisation du microscope a fluorescence

Answer 24

• distinction des cellules vivantes et mortes (fluorochromes vitaux)
  -immunofluorescence (anticorps couples à des fluorochromes)
  -détection spécifique d’une espèce: Fish (molécule d’ADN couplée à des fluorochromes) permet de quantifier une espèce sans avoir à faire de culture.

Question 25

Caractéristiques générales du microscope électronique

Answer 25

Les électrons ne traversant ni le verre ni le quartz -> des lentilles magnétiques dévient les faisceaux d’électrons: electro aimants Les électrons ne se déplace pas dans l’air mais dans le vide-> l’échantillon est mort On retransmet la lumière des électrons sur des écrans détecteur: écran fluorescent

Question 26

Comparaison de la résolution du microscope photonique et électronique

Answer 26

Photonique: 0,2 micromètre Échantillon: 0,5 nanomètre

Question 27

Pouvoir de grossissement microscope optique et électronique

Answer 27

Photonique: 1000x Électronique: 400 000x

Question 28

Limite du microscope électronique

Answer 28

Les électrons ont un faible pouvoir pénétrants, les objets doivent être très fins, techniques de fixation pour obtenir un bloc solide-> altérations Le faisceau d’électron interagit peu avec la matière-> faible contraste

Question 29

Technique d’ombrage

Answer 29

Valorisation d’une fine couche de métaux lourds avec un angle précis. Le relief génère des ombres On peut mesurer l’élévation de l’échantillon en comparant les ombres de l’échantillon et celle d’une bille de taille connue -> étude dès la morphologie des virus, flagelle, ADN

Question 30

Différente technique pour augmenter le contraste dans un microscope électronique

Answer 30

Technique d’ombrageux Coloration négative Cryodecapage Immuno localisation cellulaire

Question 31

Coloration négative

Answer 31

On fait tremper l’échantillon dans de l’acide phosphotungstique. Les métaux lourds pénètrent dans les creux qui apparaissent sombres et les reliefs apparaissent clairs -> étude des structures et du relief des microorganismes

Question 32

Cryodecapage

Answer 32

Congélation de l’échantillon (-180C) puis fracture aux zones de faiblesse -> coupe transversale pour observer l’intérieur de la cellule Après on réalise une technique d’ombrage métallique pour voir le relief à l’intérieur de la cellule

Question 33

Immuno localisation cellulaire

Answer 33

Couplage entre anticorps et billes de fer ou d’or. Lorsqu’on observe une bille sombre au microscope on sait qu’il y a l’anticorps donc la protéine virales/spécifiques à cet anticorps

Question 34

Microscope électronique à transmission (MET)

Answer 34

Les électrons traversent l’échantillon Le détecteur est sous l’échantillon -> image par transparence Limite de résolution très petite pour voir des structures très fines

Question 35

Microscope électronique à balayage (MEB)

Answer 35

Le faisceau d’électron balaye la surface de l’échantillon Le détecteur est latéral -> effet 3D Limite de résolution plu élevée

Question 36

Pourquoi utiliser des microscopes à transmission utilisant le froid

Answer 36

Éviter les altérations liée à la fixation de l’échantillon

Question 37

Méthode de préparation des microscopes utilisant le froid

Answer 37

Congélation rapide -135C dans de l’éthane ou de l’azote liquide Vitrification de l’eau pour éviter les cristaux Les structures sont conservées sous vide mais il faut que le microscope soit à température très basse

Question 38

2 types de microscopes à transmission utilisant le froid

Answer 38

Cryoelectromicroscopie Cryotomographie: les images de l’échantillon sont prises selon divers points de vue -> capture de découpe et reconstitution informatique 3D

Question 39

Microscope confocal à balayage laser

Answer 39

Microscope photonique Utilisation de laser UV et de fluorochromes Une ouverture au dessus de l’objectif bloque les rayons parasites et on capte seulement un plan précis Balayage du laser: horizontal, vertical, temporel Numérisation de l’image 3D ou 4D

Question 40

Applications du microscope confocal à balayage laser

Answer 40

- détection d’une structure dans une cellule/ tissus - développement d’un biofilm dans le temps (avec des fluorochromes vitaux) - quantification de cellules vivantes et mortes (avec des fluorochromes vitaux)

Question 41

Microscope à balayage de sonde

Answer 41

Ni photonique ni électronique Détermine le caractère de surface en déplaçant une sonde sur l’echantillon

Question 42

Microscope a effet tunnel

Answer 42

La sonde est ABC jusqu’à ce que son nuage électronique touche celui des atomes de surface. On peut mesurer le déplacement vertical et horizontal. Grossissement: 10^8 Permet de visualiser les liens intermoléculaires même immergé dans l’eau (étude de l’ADN)

Question 43

Microscope à force atomique

Answer 43

La sonde est constitué d’une pointe très fine positionnée à l’extrémité d’un levier quand la pointe est à proximité d’une surface les force d’interaction pointe/échantillons entraînent une déviation du levier. On peut étudier les surfaces qui ne conduisent pas l’électricité. On visualise les interactions entre protéines, les comportements de la cellule et on peut visualiser les protéines membranaires.