PCR

Question 1

PCR

Answer 1

Reação em Cadeia da Polimerase

Question 2

Função

Answer 2

Amplificação de uma, ou mais, amostras de DNA in vitro

Question 3

Semelhanças com a Replicação

Answer 3

1. Usa-se as duas fitas na amplificação;
2. Necessita de um primer;
3. O sentido da reação é 5’-3’

Question 4

Diferenças com a Replicação

Answer 4

1. Apenas uma região é sintetizada;
2. Primer sintetizado artificialmente;
3. A única enzima é a DNA polimerase.

Question 5

Taq polimerase

Answer 5

Enzima DNA polimerase de “Thermus aquaticus”, ativa em altas temperaturas e suporta longos ciclos de aquecimento e resfriamento. Sintetiza novas fitas à partir da sequência molde.

Question 6

Primers

Answer 6

Sintetizados artificialmente, com cerca de 21 desoxinucleotídeos orientados em cada extremidade da fita, definindo o ponto de partida para a enzima.

Question 7

Componentes da PCR clássica

Answer 7

1. Template;
2. Primers;
3. Desoxinucleotídeos;
4. Taq polimerase;
5. Solução tampão;
6. Cloreto de magnésio.

Question 8

Template (Sequência alvo)

Answer 8

Parte do DNA que deverá ser amplificada durante a reação

Question 9

Solução tampão

Answer 9

Mantém o pH em condições ideais (ótimas) para que a reação ocorra bem

Question 10

Cloreto de magnésio (MgCl2)

Answer 10

Os íons Mg2+ são cofatores da polimerase e irão determinar a eficiência e especificidade da PCR

Question 11

Cofator de Taq polimerase

Answer 11

Íons Mg2+, que atuam na estabilidade da estrutura enzimática e aumenta a afinidade com dNTPs

Question 12

Etapas da PCR

Answer 12

1. Desnaturação
2. Hibridização
3. Extensão

Question 13

Desnaturação

Answer 13

Temperatura: 94 - 98ºC
Tempo: 20 - 30 segundos
Função: Romper as ligações de hidrogênio pela temperatura elevada

Question 14

Hibridização

Answer 14

Temperatura: 50 - 65ºC
Tempo: 20 - 30 segundos
Função: Adesão dos primers às suas sequências complementares

Question 15

Extensão

Answer 15

Temperatura: 72º C
Tempo: 1 minutos para cada 1 kpb
Função: Adição de nucleotídeos e síntese da nova fita

Question 16

Controle negativo

Answer 16

Todos os reagentes, exceto amostras de DNA, a fim de atestar a qualidade do teste e ausência de contaminação

Question 17

Primer forward

Answer 17

Fita molde 3’-5’

Question 18

Primer reverse

Answer 18

Fita molde 5’-3’

Question 19

PCR multiplex

Question 20

RT-PCR