PCR Flashcards
(20 cards)
Que aplicaciones tiene la técnica de PCR? Enumera 3.
-Diagnóstico y pronostico de enfermedades, evolución y respuesta de tratamientos, estudios de expresión genética, genotipo, medicina forense, mutagénesis…
Que ventajas tiene como técnica de amplificación y detección para biología molecular ?
-Como tencica de amplificación el ahorro de tiempo y automatización ( menor detección de errores.
Y como detección, se ha de coger una muestra más pequeña y por lo tanto permite la cuantificación con PCR real time.
A que cadena de une el Paimer Forward? Y el Reverse?
-Forward: cadena 3’ - 5’
-Reverse: cadena 5’ - 3’
Cual es el sustrato ideal par la DNApol?
- La ssDNA con una pequeña región de sdDNA.
En que fase empieza siempre la PCR?
-En la fase de desnaturalización del dsDNA.
Que características importantes ha de tener la DNApol termoestable?
-Una Tª óptima de reacción; 70-75ºC, lo que le da especifidad.
-Mantener la actividad polimeradas después de largas incubaciones 95ºC (+de 40’ ), NO desnaturalización.
Que es la actividad transcirptasa inversa?
-Es la síntesi de cDNA a partir de RNA motllo en presencia de Mn+.
Dime que etapas se llevan a cabo en el termociclador de la PCR y explícalas resumidamente.
- DESNATURALIZACIÓN: subida de Tª 94-95ºC, se abren las cadenas DNA.
- HIBIDACIÓN O ANILLAMIENTO: disminución de Tº a 50-60ºC durante 30-60 minutos. Unión de praimers por complementariedad en los extremos de la secuencia target.
- EXTENSIÓN O ALARGAMIENTO: subida de Tº 72ºC durante 30 minutos, óptimo funcionamiento de Taq polimerasa ( replica ADN añadiendo nucleótidos.
Explica por encima que pasa con las temperaturas de fusión o melting a temperaturas más elevadas y menos elevadas.
-Tm más elevadas: más especidad de trabajo. con menor hibridación inespecífica de pimers y menos poductos no deseados, pero menor RENDIMINETO.
-Tm más bajas: mejor hibridación, los primers hibridan más especifidad pero hay mas obtención de productos no deseables por hibridación inespecífica.
Que productos de amplificación obtenemos en el primer ciclo del PCR?
- 2 productos no deseados y 0 productos deseados.
En que ciclo empezamos a tener amplicones?
En el tercer ciclo.
Explica brevemente los pasos de la técnica de PCR -
- mezcla de la reacción, preparación de la mezcla, dispensar el DNA molde de muestras y controles, programar el termociclador y hacer el análisis de la reacción.
Que reactivos lleva la mezcla de la reacción?
- Muestra del DNA (secuéncia a amplificar), primers, DNA polimerasa, dNPTs ( desoxinucleotidos trifosfato), buffer o tampón, Mg+ , agua purificada estéril.
Que son los primers y para que nos sirven ?
-Son fragmentos encebadores o oligonucleótidos de DNA sintéticos de longitud corta ( 20 nucleótidos) y se unen a los extremos de la sequencia a copiar.
Cual es la función de la DNA polimerasa termoestable?
Que función tiene el tampón buffer?
mantener un ph i concnetración adecuada para que funcione la DNA polimerasa.
Que condiciones importante ha de tener el DNA molde para una buena técnica de PCR?
-Buena integridad: sin fragmentar.
-Pureza adecuada: libre de contaminantes ( proteinas, fenoles, carbohidratos, sales…) que no inhiban la PCR.
-Cantidad adecuada de DNA plasmídico, genómico bacteriano o humano.
Que cantidad de DNA no puede ser superada en la reacción para que esta sea la adecuada?
-máximo 500ng por 50 microlitros.
Que volumen de reacción ha de tener el PCR mas o menos?
-Entre 25 o 50 microlitros.
