PCR Flashcards
(41 cards)
1
Q
PCR
A
Copias de DNA Taq polimerase -> extração • primer • etapas - 92C desnaturação - 60-65 anelamento - 72 extensao •analise - exponencial - linear - plato
2
Q
RT-PCR
A
•Produz cDNA atraves de RNA • copiar gene ou determinar se gene é transcrito Extração RNA -> Transcriptase reversa -> cDNA • etapas - 92 desnaturação - 60-65 anelamento - 72 extensao • protocolos - one step: menor contaminação - two step: deteccao e quantificacao
3
Q
qPCR
A
• tempo real • vantagens - maior precisão - menor contaminação - agilidade
4
Q
Northern-Blot
A
• Finalidades - detectar a expressao genica - determinar e quantificar a exp gen - determinar o splicing alternativo • preparação do material - extracao do RNA - eletroforese - northern-blotting: transferencia do rna para membrana - rna fixado com uv ou calor - hibridização com sonda - visualizacao do dna marcado no raiox
5
Q
Imuno-histoquímica
A
• metodo de localização de antigenos • usa o princípio da ligação especifica entre antigeno e anticorpo • distribuição e localização de biomarcadores • contagem: estereologia • campo claro: LSAB, ABC e PAP • Etapas - fixação - desidratação/crioprotecao - inclusão/congelamento - microtomia - coloração - análise
6
Q
Imunocitoquimica
A
- conjunto de tecnicas
- usa anticorpos para identificar celular
- identificação ocorre devido a reações específicas
7
Q
Anticorpo primario
A
- imunoglobulina
- marcação imunológica direta
- se liga à proteina particular ou biomolecula de interesse
8
Q
Anticorpo secundário
A
- marcação imunologica indireta
- se liga ao anticorpo primario
- aumenta detecção e diminui ruido
- determina o soro a ser utilizado
9
Q
Anticorpo monoclonal
A
• reconhece um epitopo especifico • produção com mieloma - linfocitos do baço - hibridoma • alto custo • tempo de produção longo • produção continua e uniforme
10
Q
Anticorpo policlonal
A
• não é especifico • composição muda a cada lote • reconhece multiplos epitopos • baixo custo e curto tempo • produção - injeta antigeno - anticorpo produzido
11
Q
Imunofluorescencia
A
- visualização de antigenos
- utiliza corantes fluorescentes
- corante ligado a anticorpo
12
Q
Bloqueio
A
- Previne ligações inespecificas
* soro determinado pelo anticorpo secundário
13
Q
Bloqueio de peroxidase endogena
A
I
14
Q
Estereologia
A
• quantificação das características tridimensionais • fracionamento - fixação - crioprotecao - congelamento - microtomia - coloração •parametros - melhor serie - counting frame - grid size - espessura real do corte - contagem
15
Q
Processamento do material biológico
A
1) fixacao
2) desidratação/ crioproteção
3) inclusão/congelamento
4) microtomia
5) coloração/histoquimica/imuno-histo
6) análise
16
Q
1) fixação
A
• objetivos - interromper o metabolismo celular - preservar estruturas - evitar autolise - impedir proliferação - resistência • formas - imersão no fixador - perfusão transcardíaca • cuidados - ph - bolhas - coagulos - lavagem inapropriada
17
Q
2) desidratação/crioproteção
A
• desidratação
- prepara material
~ parafinas e resinas
• crioproteção
- evita congelamento da agua
18
Q
3) inclusão/ congelamento
A
• consistência adequada para microtomia • preserva morfologia • meios - I: parafina, glicol metacrilato - C: resina solúvel em agua
19
Q
4) microtomia
A
• cortes finos com preservação da estrutura • planos de secção - horizontal - coronal - sagital
20
Q
5) Coloração/Histoquímica
A
• visualização no microscópio óptico
• estudo de citoarquitetura
- Nissl
- Golgi
~ corpos celulares, dendritos, axonios
~ anatomia funcional e morfologia
- Traçadores neuronais
~ deposição
~ injeção por iontoforese
~ implante de cristais
• mecanismo de captação
- captação ativa
- incorporação passiva
- captação por neurônios lesados
• transporte pelo neurônio
- vesiculas
- difusão lateral pela membrana
• detecção
- traçadores fluorescentes
- traçadores não fluorescentes
21
Q
Coloração de Nissl
A
• corante basico - corpúsculos de Nissl, nucléolo e células gliais - avermelhada - tionina (azul -arroxeado) - violeta de cresila • funções - delimitação de diferentes nucleos - mapa citoarquitetonico - contra coloração - apoptose
22
Q
Morte celular
A
• divisão fisiológica - ACD : accidental - RCD: regulated - PCD: programmed • divisão morfológica - tipo I: apoptose - tipo II: autofagia - tipo III: necrose
23
Q
Apoptose
A
• formato arredondado • picnose e condensação da cromatina • fragmentação nuclear • bolhas e engolfamento • sem alteração de organelas • relevancia: - remodelamento de órgãos e tecidos - doenças neurodegenerativas • requer atp • caspases
24
Q
Necrose
A
- oncose (aumento do vol)
- inchaço das organelas
- ruptura da membrana plasmática
- causas: calor, pH, congelamento, hipoxia
- relevancia: ovulação
- lise celular
- fragmentação aleatoria do dna
- todas as areas do tecido
- RIP1
25
Ferroptose
- peroxidação lipidica
| • intracelular
26
Piroptose
* imunidade inata
| * intra ou extra
27
Partanato
* imunidade inata
* DNA-PARP1
* intra ou extra
28
Entose
* canibalismo celular
* huntington
* privação de glicose
29
Netose
* TLRs
| * extrusão de malha de fibras contendo histona e cromatina
30
LCDC
* Lisossoma
* homeostase intracelular
* condições patofisiologicas
31
ADCD
* autofagia
* estresse celular
* sequestro celular
* ausencia de condensação da cromatina
* vacuolizacao autofagica do citoplasma
32
ICD
* immunigenic
| * resposta para antigenos endogenos e exo
33
Métodos morfológicos detecção de morte celular
```
• coloração
- hematoxilina-eosina
-Nissl
• TTC:
- analise macroscópica
- areas normais em rosa
- não cora isquemia
• microscopia eletrônica de transmissão
- condensação da cromatina
- fragmentação nuclear
- vacuolos autofagicos
- integridade da membrana
- presença de bolha
```
34
Metodos histoq, citoq e imuno-h para morte celular - TUNEL
- fase final da apoptose
| - detecção: citometria de fluxo
35
Metodos histoq, citoq e imuno-h para morte celular - Fluoro Jade
• afinidade por neuronio em degeneração
36
Metodos histoq, citoq e imuno-h para morte celular - IHC caspases
* detecção de caspases ativadas
| * citocromo c
37
Metodos histoq, citoq e imuno-h para morte celular - Anexina
* alterações na membrana celular na apoptose
| * marcador nuclear
38
Metodos histoq, citoq e imuno-h para morte celular - MTT
* viabilidade celular
| * ensaio colorimétrico sensivel, quantitativo e confiável
39
Metodos histoq, citoq e imuno-h para morte celular - LDH
* processo de morte libera LDH
| * perda de integridade da membrana
40
Metodos de imagem não invasivos
* ressonancia magnetica
* imageamento fluorescente não invasivo
* microscopia eletronica
* TUNEL
* Fluoro Jade B
* caspase 3 ativada
* TEM
41
Sequenciamento de DNA
```
• 1 geracao
- Sanger
• 2 geração
- illumina
- ion torrent
- solid
- 454
• 3 geração
- PacBio
- oxford nanopore
```
