Possíveis Questões

Question 1

Porquê os antibióticos escolhidos?

Answer 1

• Salinidade:
  Com base nos resultados da tese da Ofélia
  Estes antibióticos mostraram alterações c/ a salinidade e por isso quisemos aprofundar o assunto
• M600:
  Imipenemo e ciprofloxacina: foram usados para isolamento por isso convinha confirmar a resistência

Ampicilina e cefotaxima: porque são beta-lactamos como o imipenemo mas de outros tipos

Tetra e gentamicina: para completar com mais 2 classes de antibióticos

Question 2

Porque é que usamos E. coli, S. aureus, UC8 e FF15?

Answer 2

• estirpes de E. coli e S. aureus são estirpes clínicas
• FF15 e UC8:
  Trabalhos anteriores de colegas detectaram uma possível variação de susceptibilidades com a [ ] da água do mar

FF15 é muito resistente

UC8 vai ser usado para testes de mutações que envolvem antibióticos

Como ambas UC8 e FF15 crescem em meio salino, é previsto ter conhecimento acerca da influência da água do mar na susceptibilidade

Question 3

Porque usamos Mueller Hinton:

Answer 3

MH é um controlo padronizado para poder comparar com outros trabalhos

Question 4

Porquê aquela [ ] de solução de NaCl?

Answer 4

[ ] de NaCl no protocolo de água do mar de Kester et al.

Question 5

Porque utilizamos aquelas bact ambientais?

Answer 5

Eram marinhas pelo que é interessante mais à frente testar o efeito de água do mar na susceptibilidade

Foram isoladas usando antibióticos, por isso havia interesse em definir o perfil de resistência

Question 6

Porque não fiz análise da susceptibilidade dos ambientais ao mesmo tempo que as outras?

Answer 6

Foram isoladas + tarde

Question 7

Porque não testei bactérias ambientais em MH?

Answer 7

Foram isoladas em M600

Ainda não os tinhamos identificado quando fizemos os antibiograma e como eram de meio marinho e não sabíamos se iam crescer em meio não salino (e não havia muito tempo), avançamos c/ o meio M600 e o meio MH será feito posteriormente (atualmente)

Question 8

Porque fizemos FF15 e UC8 em M607?

Answer 8

Não tínhamos a certeza se iria crescer em MH, por isso fizemos no meio em que cultivamos

Question 9

Porque é que fizemos E.coli em S.aureus em M607?

Answer 9

Porque sabemos que eu pode haver diferenças entre meios, por isso dá-nos uma ideia se os valores das outras bactérias podem estar a ser afetados pelo meio

Question 10

Porque é que usamos aquelas concentrações de água do mar no meio?

Answer 10

O meio M607 de base é feito com 90% de água do mar e é o que usamos sempre para cultivar as bactérias. Não podia ser 100% porque as bactérias precisam de glucose, vitaminas e Hutner’s. As restantes concentrações foram si questão de ir dividindo a metade

Question 11

Porque tetra e ciprofloxacina?

Answer 11

Foram os antibióticos para os quais houve a maioria dos casos de diminuição da zona de iniciação/aumento da resistência

Question 12

Porque não fizemos os MIC em MH?

Answer 12

Não tínhamos MH líquido

Não queríamos comparar os valores padronizados, mas sim ter uma melhor visão das alterações causadas pela água do mar

Question 13

Porque é que escolhemos aquelas concentrações máximos dos antibióticos?

Answer 13

Há valores padrozinados para determinar a susceptibilidade
Escolhemos concentrações máximas que, após as diminuições seriadas, levem a um intervalo com as concentrações que englobem as concentrações padronizadas

Question 14

Porque é que os Planctomycetes não foram utilizados para os MIC:

Answer 14

Tentamos mas como demoram muito tempo a crescer houve contaminações e depois tivemos problemas c/ as culturas (não cresciam/contaminavam)

Question 15

Porque não fizemos os espectros da ciprofloxacina?

Answer 15

As curvas de espectro da ciprofloxacina eram fora do alcance do espectro do espectrofotometro e qualidade de placas que usamos

Question 16

Porque 300-600 nm?

Answer 16

No alcance do nosso espectrofotometro era o alcance que melhor servia para analisar o espectro da tetra na área do visível

Question 17

Porquê só um gene de cada vez e não análise mais ampla?

Answer 17

Plano inicial era electroforese 2D, mas decidi ao COVID (falta de tempo e trabalho por turnos), não era realista

Question 18

Porquê S.aureus em LB?

Answer 18

Meio mais simples, sem tantas variantes e no qual S.aureus cresce bem

Question 19

Porquê 0.125 ug/ml?

Answer 19

Em MICs feitos anteriormente no nosso grupo (em meio LB), foi o valor anterior à [ ] mínima inibitória.
Isto foi feito pois precisamos de uma [ ] que iria quase de certeza incentivar uma reação de defesa do S.aureus mas que ainda ia permitir ao S.aureus crescer para termos bactérias para continuar o teste

Question 20

Pq norA F/R?

Answer 20

Para analisar a expressão de gene norA

Question 21

Pq 358F e 518R?

Answer 21

Controlo positivo para reação PCR c/ cDNA.
Não tínhamos nenhuma bactéria que pudéssemos usar como controlo positivo para o norA (e tínhamos encomendado os primers pela primeira vez, pelo que não tínhamos garantia que iriam funcionar)
Precisamos dos primers 358 e 518 como controlo para ter a certeza que os resultados do norA eram válidos

Para o qPCR , também seriam necessários primers para um housekeeper gene para “normalizar” os resultados (usar como referência)

Question 22

Porquê protocolo NorA?

Answer 22

Ver expressão do NorA

Question 23

Porquê protocolo 16S?

Answer 23

Por exemplo, para confirmar cDNA (é um protocolo que usamos muito)

Question 24

Porquê 2 protocolos para a análise de expressão genética?

Answer 24

As diferenças dos protocolos poderiam estar a fazer c/ que houvesse problemas (falta de amplificação, primers a ligarem-se…)