Protein methods

Question 1

Hvad er det genomiske dogme?

Answer 1

Det er udviklingen af proteiner fra DNA til RNA til protein.

Question 2

Hvad består proteiner af?

Answer 2

Aminosyrer, som består af en central carbon atom sammensat med en aminogruppe, en carboxylgruppe, et hydrogen atom og en varibel komponent kaldet sidekæde.

Question 3

Hvilket kemikalie kan nedbryde disulfidbindinger?

Answer 3

Beta-mercaptoethanol

Question 4

Hvornår er et aminosyre en kation?

Answer 4

Ved lave pH´er

Question 5

Hvornår er et aminosyre en anion?

Answer 5

Ved høje pH´er

Question 6

Hvornår er et aminosyre en Zwitterion?

Answer 6

Ved en bestemt intermediær pH, hvor den ikke er ladet, men stadig er ioniserede

Question 7

Hvad er det isoionic point?

Answer 7

Den pH hvor Zwitterioner er dominerende

Question 8

Hvornår vil anion og zwitterion kunne være i ligevægt sammen?

Answer 8

Når pH er højere end det isoionic point (pI)

Question 9

Hvornår vil cation og zwitterion kunne være i ligevægt sammen?

Answer 9

Når pH er lavere end det isoionic point (pI)

Question 10

Hvorfor er ioniserings mønstret anderledes for aspartansyre?

Answer 10

Fordi den har to carboxyl grupper som kan ioniseres

Question 11

Hvorfor er ioniserings mønstret anderledes for Lysin?

Answer 11

Fordi den har to amino grupper, som kan modtage protoner.

Question 12

Hvordan kan små forskelle i aminosyre detekteres?

Answer 12

Electroforetisk

Ion-excange chromatografisk seperation

Question 13

Under formeringen af proteiner vil aminogrupperne og carboxylgrupperne blive brugt i peptidbindinger og kan derfor ikke længere ioniseres, udover de to terminaler. Istedet er det sidekæderne der er frie til at kunne ioniseres. Hvilke sidesæder kan der side på et peptid?

Answer 13

Aminogrupper 
Carboxylgrupper 
Amidazolyl grupper Guanidino grupper 
Phenolic grupper 
Sulphyldryl grupper

Question 14

Når proteiner folder, hvor vil sidekæderne da placerer sig og hvilken funktion har de for proteinet?

Answer 14

De vil så vidt muligt side på ydersiden af proteinet så de interagerer med omgivelserne.
Derudover hjælper de til at danne den tertiære struktur.

Question 15

Hvad er det isoelectriske punkt for et protein?

Answer 15

Den pH hvor proteinet er elektroforetisk immobilt.

Question 16

Hvad bruges en extraction buffer til og hvad er vigtigt i sammensætningen af den?

Answer 16

Den bruges til at stabiliserer de proteiner, som man gerne vil udvinde.
Derfor er det vigtigt at pH´en er det samme som inde i cellen.
Dertil er der specielle tilsætninger alt efter hvilke proteiner man ønsker at isolerer.

Question 17

Hvad er de mest brugte extraction buffers?

Answer 17

Tris

Phosphate

Question 18

Hvad gør anti-oxidanter i en extraction buffer?

Answer 18

Forhindre inter- og intramolekulære disulfidbindinger mellem proteiner som frigives i bufferen.

Question 19

Nævn nogle anti-oxidanter

Answer 19

Dithiothreitol
Beta-mercaptoethanol
Cystein
Glutathion

Question 20

Hvad gør enzym-inhibitorer i en extraction buffer?

Answer 20

Blokerer proteaser og proteolytiske enzymer fra lysosomer, der kan skade proteinerne.

Question 21

Udover enzym-inhibitorer hvad kan man ellers gøre for at forhindre proteolyse?

Answer 21

Under hele oprensningen arbejdes der ved 4 grader.

Question 22

Hvad gør enzym substrat og cofaktorer i en extraction buffer?

Answer 22

Stabiliserer enzymer ved at substratet binder til den aktive del af enzymet. De relevante cofaktorer som mistes i oprensningen tilføjes for at vedligeholde enzym aktiviteten.

Question 23

Hvad gør EDTA i en extraction buffer?

Answer 23

Fjerner metalioner som reagere med thiol gruppen i proteiner.
Fjerner også magnesium og calcium.

Question 24

Hvad gør sodium azide i en extraction buffer?

Answer 24

Holder bufferen fri for bakterier og svampe så det opbevares i længere tid.

Question 25

Membran proteiner er svære at udvinde da de ikke frigøres ved almindelig ødelæggelses procedure. Hvilke to former for membran proteiner finde der?

Answer 25

Extrinsiske og intrinsiske

Question 26

Hvordan oprenser man extrinsiske membran proteiner?

Answer 26

Hæve ionisk konc. i extraktionsbufferen til 1 M NaCl | Ændre pH til 3-5 eller 9-12.

Question 27

Hvordan oprenser man intrinsiske membran proteiner?

Answer 27

Bufferen skal have tilført detergenter, såsom SDS, sodium deoxycholate Eller non-ionic detegenter såsom Triton x-100

Question 28

Hvordan kan mammalian celler blive ødelagt?

Answer 28

ved shear forces

Question 29

Nævn de forskellige typer af metoder til at ødelægge celler

Answer 29

``` Blenders Slibning Presning Enzymatiske metoder Lydbølger ```

Question 30

Hvilken celler ødelægger man med blender metoden?

Answer 30

Mammalian celler eller plantevæv, da blendning opbygger shear forces.

Question 31

Hvilken celler ødelægger man med slibning metoden?

Answer 31

Planteceller | Bakterier

Question 32

Hvilken celler ødelægger man med presning metoden?

Answer 32

Mikrobakterielle celler

Question 33

Hvilken celler ødelægger man med enzymatisk metoden?

Answer 33

Gram-positive bakterier Gram-negative bakterier Svampe/gær

Question 34

Hvilken celler ødelægger man med lydbølge metoden?

Answer 34

Mammalian celler | Mikrobakterielle celler

Question 35

Hvad er ideen bag fraktionerings metoder?

Answer 35

At inddele proteiner yderligere i f.eks. hydrofobe og hydrofile, som vil gøre oprensningen nemmere.

Question 36

Nævn nogle fraktionerings metoder man kan bruge

Answer 36

Ladning Størrelse Affinitet Hydrophobisitet

Question 37

Hvilke fraktionerings metoder kan bruges inden oprensning?

Answer 37

Hydrofobicitet | Ladning

Question 38

Hvilke fraktionerings metoder kan bruges efter oprensning?

Answer 38

Affinitet | Størrelse

Question 39

Proteiner kan blive modificeret ved overudtrykke gener for proteiner frem for at klone dem, som gøres for at sikre sekretion af proteiner fra cellen eller som et mål for oprensning af proteiner. Hvad er fordelen ved at modificerer gener for proteiner?

Answer 39

Der vil være mindre kontaminering af andre proteiner, da cellen frigiver det til mediet. Undgår nedbrydning af proteinet i cellen Undgår at proteinet bliver toksisk for cellen Proteinerne undergår post-translationelle modifikationer

Question 40

For at sikre at man selektivt oprenser sit protein tilføjer man et ekstra gen til genet for proteinet, kaldet fusion protein. Når proteinet bliver udtrykt kan fusion proteinet kløves væk for at frigive proteinet. Nævn eksempler på fusion proteiner

Answer 40

``` Flag^TM Glutathione affinity agarose Protein A Poly(arginin) Maltose bindende protein tag (MBP) His tag ```

Question 41

Beskriv hvordan Flag bruges i oprensning

Answer 41

En aminosekvens påsættes N-terminalen af proteinet Et monoklonal Flag antistof tilsættes sammen med calcium, da det er calcium afhængigt. Herefter tilsættes EDTA som binder til calcium og derved frigiver Flag proteinet Enterokinase tilsættes som fjerner Flag sekvensen

Question 42

Beskriv hvordan glutathion affinity agarose bruges i oprensning

Answer 42

Sit protein er udtrykt som et fusions protein med enzymet glutathion S-transferase siddende på sig. extraktet filtreres igennem et rør med glutathion ´-linked agarose beads, som enzymet vil binde til. Når alt det protein som ikke har fusions protein på sig er løbet igennem kan man tilsætte en elution blanding som består af reduceret glutathion. Til sidst kløves fusions proteinet vha. human trombin

Question 43

Beskriv hvordan protein A bruges i oprensning

Answer 43

Sit protein er fusioneret med Protein A, som kan binde til Fc regionen af IgG. Efter oprensning kan IgG fjernes vha. en hæj saltopløsning eller lav pH Herefter fjernes protein A fra sit protein ved at behandle det med 70% formic acid i 2 dage, som kløver den syre-labile Asp-Pro binding i linker regionen.

Question 44

Beskriv hvordan Maltose binding protein (MBP) tag kan bruges i oprensning

Answer 44

Sit protein er fusioneret med MBP, som kan oprenses ved at tilføje amylose resin. Amylose resin kan efter oprensning fjernes med maltose. MBP delen kan fjernes ved en specifik protease Sit protein kan herefter seperares fra MBP ved at bruge affinity chromatografi.

Question 45

Nævn forskellige chromatografi metoder

Answer 45

Affinity chromatografi Ion exchange chromatografi Size exclusion chromatografi

Question 46

Hvordan fungerer Affinity chromatografi?

Answer 46

Ved at isolerer sit protein på baggrund af dens binding til en ligand

Question 47

Hvordan fungerer ion exchange chromatografi?

Answer 47

Ved at isolerer sit protein på baggrund af dens ladning

Question 48

Hvordan fungerer size exclusion chromatografi?

Answer 48

Ved at isolerer sit protein på baggrund af dens størrelse

Question 49

Hvad er den gennemgående metode til at måle protein koncentrationer?

Answer 49

At man farver med et farvestof der binder til proteinet, som derefter kan detekteres spektrofotometrisk.

Question 50

Beskriv kort hvordan affinity chromatography virker

Answer 50

Man har et rør hvor der er matrix i. I matrixen er der noget der hedder en spacer, som gør at liganden ikke binder direkte til matrixen. Herefter tilsættes liganden til matrixen og ens proteiner tilføjes. Kontaminerede proteiner vaskes ud af prøven. Det bundne protein kan fjernes ved at ændre ion konc. eller pH eller ved en kompatativ substans, som senere kan fjernes på samme måde.

Question 51

Hvilke typer matrix kan bruges i affinity chromatography

Answer 51

``` Agarose Polycrylamide Polystyrene Cellulose Silica ```

Question 52

Nævn de to exchanger den stationerer fase kan være i ved ion exchange chromatography og hvad forskellen er på de to

Answer 52

Cation exchanger, som er negativ ladet = positive proteiner | Anion exchanger, som er positiv ladet = negative proteiner

Question 53

Hvad kan bruges som cation exchanger?

Answer 53

Carboxyl Carboxyl methyl Sulpho Sulpho methyl

Question 54

Nævn de buffere man bruger med en cation exchanger

Answer 54

Acetat Phosphat Succinate Lacetate

Question 55

Hvad kan bruges som anion exchanger?

Answer 55

Aminoethyl | Trimethyl aminoethyl

Question 56

Nævn de buffere man bruger med en anion exchanger

Answer 56

Tris | Pyridin

Question 57

Hvad er røret i size excange chromatography fyldt med?

Answer 57

Gel med purose beads

Question 58

Hvad kan gelen bestå af i size excange chromatography?

Answer 58

Polystyrene Dextran Polyacrylamide Agarose gel