Rekombinace + Mobilní genetické elementy Flashcards
Obecná rekombinace
- = Genetická výměna mezi jakýmkoli párem dlouhých homologních DNA sekvencí - často lokalizovaných na 2 kopiích stejného chromozomu
- např. Crossing over
- Základní mechanismus je stejný -> 2 Homologní sekvence -> vznik HOLLYDAYOVY STRUKTURY a heteroduplexního spojení
- většinou nedochází ke změnám sekvencí
Rekombinace E. Coli - Začátek (Rec enzymy)
- 3 dráhy využívají mechanismus ds přerušení -> Hollydayova struktura -> migrace ramen -> štěpení a ligace
- REC BCD enzymy:
-> rozpozná 2 řetězcové zlomy, při poškození
-> Zvyšuje rekombinaci nedaleko místa CHI
-> naváže se na konec ds zlomu -> degradace
-> REC B = exonukleáza + rozbaluje molekulu
-> REC C = rozpoznává CHI místa, ovlivňuje D
-> REC D = helikáza, ovlivňuje B - CHI místo:
-> vyšší frekvence rekombinace
-> asi 1/5 genů
-> GCTGGTGG
-> Když na něj narazí Rec BCD, sníží se exonukleázová aktivita 3’->5’, ale zvýší se 5’->3’ (přečnívá, na to pak nasedne Rec A) - Rec A:
-> navazuje se na 3’ konec vlákna 5’->3’
-> tvorba Hollydayovy struktury
-> s navázáním mu pomáhají SSB proteiny
-> Spotřeba ATP
-> Hlavně musí správně přivést ss rameno do dsDNA, pak je štěpení ATP -> ATP-> ADP -> uvolnění Rec A - Po navázání ss ramena pomocí Rec A jdou na scénu Ruv proteiny
Rekombinace E. Coli - Ruv proteiny
- Ruv A = ,,kruh’’, specificky rozezná Hollydayovu strukturu
- Ruv B = helikázová aktivita -> bezpečná migrace ramen, otáčí DNA dovnitř jako šroub
- Ruv C endonukleáza = 2 proteiny 180 stupňů proti sobě, štěpí řetězce, na které se navazuje -> propojení -> rekombinace
Umělá Hollydayova struktura
- Syntetické oligonukleotidy -> smíchání
- RuvA, RuvB, ATP
- -> Migrace ramen
Rekombinace Eukaryota
- Homologní rekombinace během meiózy
Spo11 protein: - váže se do míst dsDNA štěpení (na 5’ konec)
- specifická místa se zvýšenou frekvencí rekombinace (jako CHI)
MRX komplex:
- váže se na dsDNA s navázaným Spo11
- komplex 3 proteinů
- Odbourá řetězec z konce spoje se Spo11 (5’ konec) -> 5’ konec se zkracuje a uvolní se Spo11
- takhle vznikne zase 3’ přečnívající konec
Dmc1 a Rad51:
- homology Rec A
- rozeznávají delší 3’ konec
- tvoří nukleoproteinové vlákno a provádí invazi ramen a tvoří tak Hollydayovou strukturu
Místně specifická rekombinace
- -> Není nutná DNA homologie
- Rekombinace v krátkých specifických nukleotidových sekvencích -> rozpoznané místně specifickými rekombinačními enzymy
- Specifická sekvence na jedné či obou rekombinujících molekulách
Místně specifická rekombinace
- -> Není nutná DNA homologie
- Rekombinace v krátkých specifických nukleotidových sekvencích -> rozpoznané místně specifickými rekombinačními enzymy
- Specifická sekvence na jedné či obou rekombinujících molekulách
KONZERVATIVNÍ M-S REKOMBINACE:
- specifické sekvence se vyskytují na obou DNA a rekombinace funguje oběma směry (inzerce, delece)
- např. Integrace bakteriofága λ
- není možné srovnávat s homologní rekombinací
TRANSPOZIČNÍ M-S REKOMBINACE:
- typická pro mobilní DNA sekvence, např. transposony
-> kdy kódující integrázy provádějí inzerci do genomu a rozpoznávají specifické sekvence mobilního elementu, který se vkládá
-> ALE provádějí integraci do random míst genomu, takže nejsou potřeba specifické sekvence v genomu
-> NEtvoří heteroduplex a nejsou žádné homologní sekvence
- Integrace bakteriofága P1:
-> kóduje Cre protein
-> metoda Rolling circle -> multimerní DNA (víc genomů bakteriofága), oddělení LOX P místy
-> rekombinace mezi Lox P místy pro vytvoření jednotlivých genomů bakteriofága, vyštěpení genomu - Molekulární mechanismus fce Cre proteinu:
-> = rekombináza
-> na obě Lox P místa se naváže Cre protein -> 1. štěpení DNA v obou molekulách -> 2. ss štěpení u obou molekul -> vznik fosfotyrosinové vazby -> Hollydayova struktura -> další štěpení, produkt má na sobě Cre protein, který mizí pryč
Mobilní genetické elementy - autor, typy
- Transpoziční M-S rekombinace
- Barbara McClintock (1940), modely na kukuřici 🌽
- 1.TRANSPOSONY:
- transpozice DNA
- spíš Prokaryota
- intermediát je DNA -> vkládá se do random místa
- IS elements, Bacterial transposons, Eukaryotic transposons
- 2.RETROTRANSPOSONY:
- spíš Eukaryota
- RNA intermediát -> reverzní transkripce -> DNA intermediát -> vkládá se do jiné části genomu
- Viral/Non-viral transposons
Mobilní genetické elementy - Bakteriální IS elementy
= Insertion sequence
- identifikace el. mikroskopií -> hybridní molekuly DNA wt (rodičovských) kmenů a kmenů s mutacemi
- víc než 20 různých elementů u E. Coli a dalších bakterií
- transpozice do náhodného místa, přenos přes plasmidy nebo viry
- enzym zde kódovaný je TRANSPOZÁZA - nereplikativní transpozice IS elementů (vyštěpí IS, udělá konce, liguje konce k IS elementu)
- tupé konce = donorová DNA
- lepivé konce = akceptorová DNA
- aby nedocházelo k mnoha mutacím, udržuje se transpozice a kopírování IS elementů na nízké hladině
Mobilní genetické elementy - Bakteriální elementy
- větší než IS elementy
- nesou další proteiny
- dva IS elementy v určité vzdálenosti od sebe, přesouvají se oba dohromady a s tím, co je mezi nimi (kódující sekvence)
Mobilní genetické elementy - Eukaryotické transpozony
- Ac, Ds elementy (kukuřice), P elementy (Drosophila) = Nereplikativní transpozice
- Při přesunu elementu nedochází k jeho zdvojení
Mobilní genetické elementy - Replikativní DNa transpozice
- Bakteriofág Mu (Mutator, při množení vyvolává mutace)
- Jednořetězcové štěpení na obou stranách transpozonu -> napojí se na ss štěpené místa cílové DNA -> napojení
- KOINTEGRÁT = 2 cílové cirkulární molekuly spojené 2 kopiemi transpozonů
Mobilní genetické elementy - Virové retrotranspozony s LTR
- nutná reverzní transkriptáza
- podobné retrovirům
- na koncích LTR (long terminal repeats)
- vždy replikativní transpozice, původní transpozon zůstává na místě
- levý LTR - obsahuje promotor pro RNA pol. II
- LTR - 3 oblasti: U3, R, U5
- Vznik RNA díky host. RNA pol. II -> po transkripci se přidá polyA sekvence mezi pravým R a U3
- výsledný genom začíná a končí R, nemá úplné LTR části
ÚPRAVA, PŘIDÁNÍ LTR SEKVENCÍ: - tRNA k levé U5 oblasti (PBS = primer binding site)
- tRNA se váže na PBS -> tRNA je primer -> syntéza -> přijde reverzní transkriptáza -> DNA intermediát
- ## retrovirová DNA, Ty elementy kvasinek, Copia elementy
Mobilní genetické elementy - Nevirové retrotranspozony bez LTR
- LINEs elementy = long interspersed elements
- SINEs elementy = short interspersed elements
- Savčí buňky - 10 skupin LINES, 1 SINES
- největší lidské SINES - Alu sekvence
MNOŽENÍ RETROELEMENTU: - Syntéza LINE RNA s polyA -> cytosol -> translace kódujících sekvencí -> produkty ORF1 a ORF2
- ORF1 se váže na LINE RNA (v mnoha kopiích)
- ORF2 se váže na polyA ocásek
- transport zpět do jádra blízko genomové DNA -> ORF2 štěpený na straně A-T bohatých oblastí
- reverzní transkripce LINE RNA pomocí ORF2
