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relatorio Flashcards

(84 cards)

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1
Q

Q: Qual é o papel da Imunohistoquímica (IHQ) no diagnóstico de melanoma?

A

IHQ ajuda a distinguir lesões melanocíticas de outras proliferações benignas ou malignas com morfologia semelhante.

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Q

Q: Quais são os principais marcadores utilizados para células melanocíticas?

A

A: Melan-A, S100, SOX10 e HMB-45.

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3
Q

Q: Por que o HMB-45 é amplamente utilizado?

A

A: Pela sua especificidade para melanócitos imaturos e células de melanoma.

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4
Q

Q: Qual o sistema de deteção utilizado no protocolo?

A

A: Sistema de polímero indireto com enzima HRP (Horseradish Peroxidase).

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5
Q

Que vantagens tem o sistema polímero indireto com HRP em relação ao método avidina-biotina?

A

Maior sensibilidade, menos artefactos e ausência de interferência com biotina endógena.

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6
Q

passos

A

microtomia
desparafinação e hidrataçaõ
3. Bloqueio da Peroxidase endógena:
4. Recuperação Antigénica:
5. Arrefecimento gradual:
Lavagens
7. Incubação com Anticorpo Primário Anti-HMB-45:
8. Lavagem com PBS:
9. Incubação com Sistema de Deteção-EnVision HRP
10. Lavagem com PBS:
11. Revelação com DAB:
12. Lavagem com água corrente:
13. Contraste com Hematoxilina de Harris
14. Desidratação:
finalizar com xilol
montagem

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7
Q

Q: Qual a espessura dos cortes histológicos feitos na microtomia?

A

A: cortes seriados com 2 a 4 μm.

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8
Q

o que se faz dps dos cortes

A

banho-maria a 45ºC para Esticar os tecidos sobre a lâmina.

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9
Q

Pergunta: Qual o nome da substância usada para adesivar as lâminas na microtomia?

A

Resposta: APES (3-aminopropil-trietoxisilano).

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10
Q

Pergunta: Como o APES promove a adesão do tecido à lâmina?

A

Resposta: Através de ligações covalentes com a superfície da lâmina.

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11
Q

Pergunta: Porque é comum a utilização de APES apesar das suas desvantagens?

A

Resposta: Pela sua elevada eficácia na adesão de tecidos às lâminas.

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12
Q

Pergunta: Quais são as desvantagens do APES?

A

Resposta: É tóxico, corrosivo e tem curto tempo de vida útil (começa a perder propriedades após 30 minutos da preparação).

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13
Q

Pergunta: Quanto tempo devem as lâminas ser imersas em APES 2% em acetona?

A

Resposta: 30 minutos.

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14
Q

Pergunta: Qual o procedimento após a imersão das lâminas em APES?

A

Lavar abundantemente com água corrente por 10 minutos,

Passar por água destilada,

Deixar secar à temperatura ambiente durante a noite, ou a 37°C na estufa “overnight”, ou a 60°C por pelo menos 1 hora.

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15
Q

Pergunta: Por que se deve secar as lâminas após o processo com APES?

A

Para fixar os cortes, evitar o descolamento e eliminar parafina residual.

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16
Q

Pergunta: Qual é o objetivo da desparafinação nas secções histológicas?

A

Resposta: Remover totalmente a parafina.

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17
Q

Pergunta: Qual o reagente utilizado na desparafinação?

A

Resposta: Xilol.

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18
Q

Pergunta: Qual a sequência de hidratação após a desparafinação?

A

Álcool 100%, 96% e 70%, por 2 minutos cada, seguido de água destilada por 2 minutos.

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19
Q

Pergunta: Por que é importante hidratar bem o tecido após a desparafinação?

A

para permitir que os reagentes aquosos penetrem adequadamente e o tecido não fique com aspeto gorduroso.

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20
Q
A
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21
Q

O que indica um aspeto gorduroso no tecido após a desparafinação e hidratação?

A

Resposta: Que não foi bem hidratado.

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22
Q

Pergunta: O que deve ser feito se o tecido apresentar aspeto gorduroso?

A

Resposta: Repetir os passos anteriores de desparafinação e hidratação.

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23
Q

Pergunta: Qual é o objetivo do bloqueio da peroxidase endógena?

A

Inativar a atividade da peroxidase endógena presente nos tecidos, evitando marcações falsas positivas.

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24
Q

Pergunta: Qual reagente é usado para bloquear a peroxidase endógena?

A

Resposta: Peróxido de hidrogénio (H₂O₂) a 1,5–3% diluído em água destilada.

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25
Pergunta: Quanto tempo dura a incubação com H₂O₂ para bloquear a peroxidase?
10 min
26
Pergunta: Quando deve ser feito o bloqueio da peroxidase endógena?
Resposta: Após a desparafinação e hidratação do tecido.
27
Por que é importante bloquear a peroxidase endógena antes da deteção com HRP?
: Para garantir que a reação enzimática ocorra apenas no local do anticorpo ligado ao antigénio de interesse, evitando ligações inespecíficas.
28
Em que tipos de tecidos o bloqueio da peroxidase endógena é especialmente importante?
Tecidos com elevada atividade de peroxidases endógenas, como baço, rins, medula óssea, fígado e zonas de necrose ricas em glóbulos vermelhos.
29
Qual é o objetivo da recuperação antigénica?
Restaurar epítopos antigénicos modificados ou mascarados pela fixação com formaldeído.
30
O que acontece durante a fixação com formaldeído que interfere com os antigénios?
Formam-se ligações cruzadas como pontes de metileno, que podem mascarar os epítopos.
31
Qual tampão é normalmente utilizado na recuperação antigénica e qual o seu pH?
Tampão Tris-EDTA com pH 9,0.
32
Pergunta: Qual é o papel do EDTA na recuperação antigénica?
Atua como agente quelante, removendo iões de cálcio que estabilizam proteínas.
33
Pergunta: Como se realiza a recuperação antigénica com micro-ondas?
Submersão das lâminas em tampão Tris-EDTA e aquecimento a 750 W durante 20–30 minutos.
34
Por que se pode adicionar Tween 20 ao tampão de recuperação?
Para melhorar a permeabilização das membranas, facilitando o acesso dos anticorpos.
35
Por que é importante atingir o ponto de ebulição da água e o ponto de fusão da parafina durante a recuperação?
Para garantir a eficácia da quebra das ligações cruzadas e permitir a exposição dos epítopos.
36
: Onde devem ser colocadas as lâminas no micro-ondas durante a recuperação antigénica?
Na periferia do prato do micro-ondas, para evitar danos térmicos causados por calor excessivo no centro.
37
Que outros métodos podem ser utilizados para a recuperação antigénica além do micro-ondas?
Resposta: Panela de pressão, autoclave e banho-maria quente.
38
Qual o objetivo do arrefecimento gradual após a recuperação antigénica?
Evitar choque térmico, prevenir o descolamento dos cortes e preservar a morfologia e estrutura proteica.1
39
Quanto tempo deve durar o arrefecimento das lâminas após a recuperação antigénica?
Resposta: Cerca de 15 minutos à temperatura ambiente.
40
Pergunta: Onde devem permanecer as lâminas durante o arrefecimento?
Resposta: No tampão utilizado na recuperação ou em água.
41
Que estruturas proteicas são favorecidas pelo arrefecimento gradual?
A conformação terciária e quaternária das proteínas, garantindo epítopos acessíveis e estáveis.
42
Pergunta: Qual a primeira lavagem após o arrefecimento e qual a sua duração?
avagem com água destilada por 2 minutos para remover resíduos do tampão.
43
Pergunta: Qual é o objetivo da lavagem com PBS 1x + 0,2% Tween 20?
Estabilizar o pH, manter integridade estrutural e reduzir ligações inespecíficas.
44
Pergunta: Quanto tempo deve durar a lavagem com PBS + Tween 20?
Resposta: Cerca de 5 minutos.
45
Pergunta: Qual é a função do Tween 20 na lavagem com PBS?
Atua como detergente não iónico, reduzindo coloração de fundo e facilitando penetração de reagentes.
46
Pergunta: Que técnica é recomendada para uma lavagem eficaz dos cortes?
Agitação leve ou troca manual da solução para garantir contacto homogéneo com os cortes.
47
ual é o anticorpo utilizado na incubação para deteção de marcadores melanocíticos?
Resposta: Anticorpo monoclonal anti-HMB-45 (clone HMB-45).
48
Pergunta: Qual a diluição recomendada para o anticorpo anti-HMB-45?
Resposta: 1:100 — 5 µL de anticorpo concentrado em 495 µL de tampão.
49
Pergunta: Que tipo de tampão deve ser usado para diluir o anticorpo primário?
Resposta: Tampão apropriado sem detergentes.
50
Por quanto tempo e a que temperatura se faz a incubação do anticorpo primário anti-HMB-45?
30 minutos à temperatura ambiente, numa estufa para evitar evaporação.
51
Pergunta: Por que é crítica a etapa de incubação com o anticorpo primário?
Porque a ligação ao antigénio é específica e depende da temperatura, concentração e tempo corretos.
52
Quanto tempo deve durar a lavagem com PBS após incubação com anticorpo primário?
3 a 5 minutos.
53
Pergunta: Qual é a principal função do tampão PBS nas lavagens?
Estabilizar o pH fisiológico dos tecidos e evitar marcações inespecíficas.
54
Pergunta: O que são soluções tampão e qual é a sua função?
Soluções constituídas por ácido fraco e sua base conjugada (ou vice-versa), usadas para manter o pH estável.
55
Pergunta: Qual é o papel do Tween 20 nas lavagens com PBS?
: Reduz marcações inespecíficas, dissolve lípidos, promove permeabilização das membranas e melhora dispersão dos reagentes.
56
Pergunta: O que é o sistema de deteção EnVision HRP?
Um sistema indireto de elevada sensibilidade, baseado em um polímero de dextrano ligado a anticorpos secundários anti-IgG e à enzima HRP (peroxidase de rábano).
57
Pergunta: Qual a função do polímero de dextrano no sistema EnVision HRP?
Transportar múltiplas moléculas de anticorpo secundário com HRP para amplificação do sinal.
58
Pergunta: Quais as principais vantagens do sistema EnVision HRP?
Alta sensibilidade devido à multiplicidade de enzimas HRP. Não utiliza avidina/biotina, evitando interferência de componentes endógenos.
59
Pergunta: Qual a principal desvantagem do sistema EnVision HRP?
: O grande tamanho do polímero pode dificultar o acesso a antigénios pouco acessíveis (sobretudo nas primeiras gerações).
60
Pergunta: Como deve ser aplicada a solução de EnVision HRP nos cortes?
Uniformemente sobre o tecido, com incubação de 30 minutos em câmara húmida.
61
Por que se realiza uma lavagem com PBS após incubação com EnVision HRP?
Para remover o excesso de reagente não ligado, assegurando a especificidade da revelação com o cromogénio.
62
Pergunta: Como deve ser realizada a lavagem com PBS 1x após EnVision HRP?
Durante 3 a 5 minutos, com agitação leve ou trocas manuais sucessivas.
63
Pergunta: Qual é o princípio da reação de revelação com DAB?
HRP catalisa a oxidação do DAB na presença de H₂O₂, formando um precipitado castanho insolúvel no local da marcação.
64
Pergunta: O que indica a intensidade da coloração com DAB?
Resposta: É proporcional à quantidade de antigénio presente no tecido.
65
Pergunta: Quanto tempo deve durar a incubação com DAB e por que é crítica?
Resposta: Cerca de 8 minutos, sob vigilância visual. Tempos excessivos causam sobrecoloração e fundo elevado; tempos curtos reduzem a sensibilidade.
66
Qual a função da lavagem com água corrente após a revelação com DAB?
Interromper a reação da peroxidase, evitando precipitação cromogénica inespecífica, e remover resíduos do DAB e outros reagentes. Deve durar 2–5 minutos com fluxo suave e lâminas na vertical. \
67
Por que é importante manter as lâminas na vertical durante a lavagem com água corrente?
Para evitar o descolamento dos cortes e garantir que toda a superfície do tecido seja lavada uniformemente.
68
Qual o objetivo do contraste com hematoxilina na IHQ?
Evidenciar os núcleos celulares, fornecendo um fundo morfológico para interpretar a distribuição do antigénio marcado.
69
Quais as diferenças entre Hematoxilina de Harris e de Mayer?
Harris: Coloração nuclear mais delicada, usada para preservar a nitidez da marcação. Tempo: 1–1,5 min. Mayer: Mais rápida e intensa, indicada para rotina.
70
O que é o “azulamento” na coloração com hematoxilina?
Lavagem com água destilada ou solução levemente alcalina para estabilizar a coloração azul dos núcleos.
71
Qual a ordem correta dos banhos alcoólicos na desidratação de tecidos?
Etanol 70% → Etanol 96% → Etanol 100%, de forma gradual para evitar artefactos.
72
Frente: Por que a desidratação deve ser gradual?
: Para evitar danos nas células, como rutura de membranas, vacúolos ou fissuras, preservando a morfologia do tecido.
73
: Qual o objetivo do banho em xilol após desidratação?
Remover o álcool residual e tornar o tecido transparente para facilitar a montagem e observação microscópica.
74
O que é feito na etapa de montagem das lâminas em IHQ?
Aplica-se meio de montagem resinoso sobre o corte e cobre-se com lamela, evitando bolhas. Protege o tecido, a coloração e melhora a leitura ao microscópio.
75
Q: Qual a finalidade da solução APES no preparo das lâminas?
Promover a adesão dos cortes à lâmina.
76
Q: O que indica perda de propriedades da solução de APES?
A: Mudança de cor (ganho de cor).
77
Q: Como preparar 100 mL de H₂O₂ a 3% a partir de H₂O₂ a 30%?
A: Usar 10 mL de H₂O₂ a 30% + 90 mL de água destilada.
78
Q: Tipo de anticorpo?
A: HMB45-L-CE. A: Monoclonal de rato, anti-humano em diluição 1:60
79
Q: Temperatura de armazenamento do anticorpo?
A: 2–8ºC.
80
Q: Como preparar 500 µL de anticorpo a 1/100?
A: 5 µL de anticorpo + 495 µL de tampão.
81
Q: Como corrigir pH de uma solução de Tris-EDTA?
A: Com HCl (se pH básico) ou NaOH (se pH ácido).
82
Q: O que é essencial para validar um ensaio imunohistoquímico?
A: Controlos positivos e negativos.
83
Q: Quem deve interpretar os resultados?
A: Um patologista qualificado.
84
Q: Que EPI é necessário durante o manuseamento dos reagentes?
A: Luvas, bata, óculos de proteção (EPI adequados).

imuno histoquimica- relatorio (1 decks)

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