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Molekularbiologie > RNA Interferenz in Eukaryoten > Flashcards

RNA Interferenz in Eukaryoten Flashcards

(44 cards)

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1
Q

Was sind zwei Beispiele von RNA-mediated Gene Silencing?

A
  1. RNA-Interferenz (RNAi) oder Post-transcriptional gene silencing (PTGS)
  2. Transcriptional gene silencing (TGS)
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2
Q

Was ist RNA-Interferenz (RNAi) oder Post-transcriptional gene silencing (PTGS)?

A

Kleine doppelsträngige RNA-Moleküle führen in Assoziation mit einem zellulären Proteinkomplex zur sequenzspezifischen Suppression der Target-Genexpression durch Spaltung der Target-mRNA

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3
Q

Was ist Transcriptional gene silencing (TGS)?

A

Inhibition der Transkription durch epigenetische Modifikation des Chromatins (z.B. Rekrutierung von Histon- und DNA-modifizier enden Enzymen)

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4
Q

Rätselhafte experimentelle Daten (1990) mit dem Ziel: kräftigere Blütenfarbe in Petunien.
Was war der experimentelle Ansatz und desen Ergebnis?

A
  • Experimenteller Ansatz: Insertion eines Transgens zur Bildung von violetten Pigmenten
  • Ergebnis: Viele Blumen verloren die Farbe, anstatt mehr Pigmente auszubilden
  • Beobachtung: Deutliche Erniedrigung der endogenen als auch der transgenen mRNA
    -> Ko-Suppression homologer Gene
  • Der Phänotyp blieb über Monate erhalten, übertrug sich auf wachsende Pflanzenteile und war vererbbar
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5
Q

Schlüsselexperiment in Caenorhabditis elegans (1998) mit dem Target Gen: unc .22 (kodiert für ein nicht essentielles Myofilament Protein).
Was wurde beobachtet?

A
  • Keine oder marginale Effekte mit sense RNA (identisch mit unc 22 mRNA) oder antisense RNA (komplementär zur mRNA)
  • Bewegungsdefekte mit doppelsträngiger (ds) unc 22 RNA; Verlust der Muskelkontrolle führt zu unkoordinierten („ unc “) Bewegungen und sichtbaren Zuckungen
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6
Q

Weiterführende Experimente mit muscle excess3 (mex-3).
Welcher Zusammenhang besteht zwischen Injektion von dsRNA und gene silencing?

A

Nach Injektion von mex-3 dsRNA, Verlust der natürlichen mex-3 mRNA
-> Keine endogene mex-3 mRNA detektierbar (D)
-> Injizierte dsRNA bewirkt eine potente und spezifische Interferenz der targetierten mRNA (RNA-Interferenz (RNAi))

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7
Q

Wo wird mex-3 exprimiert? Was ist seine Rolle?

A
  • Expression von mex-3 in Gonaden und Embryonen
  • Aufrechterhaltung der Totipotenz in den Keimzellen und Spezifikation des Zellschicksals im frühen Embryo
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8
Q

Wodurch wird gene silencing effizient?

A

durch dsRNA

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9
Q

Wofür ist RNA-Interferenz komplementär?

A

für komplementäre mRNA

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10
Q

Wogegen muss der dsRNA für RNA-Interferenz gerichtet sein?

A

dsRNA muss gegen reife mRNA-Sequenz gerichtet sein, nicht gegen Promotorregionen oder Introns
(Hinweis auf post transkriptionellen Mechanismus im Zyt plasma)

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11
Q

Schlussfolgerungen RNA-Interferenz

A
  • Effizientes gene silencing nur durch dsRNA
  • Spezifisch für komplementäre mRNA
  • Degradation der mRNA
  • dsRNA muss gegen reife mRNA-Sequenz gerichtet sein, nicht gegen Promotorregionen oder Introns
    (Hinweis auf post transkriptionellen Mechanismus im Zyt plasma)
  • Bereits wenige Moleküle ausreichend für vollen Effekt
    (Katalytische Aktivität oder Amplifikationsschritt)
  • Effekt kann sich in Geweben ausbreiten (systemische RNAi) und vererbt werden
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12
Q

In welchen Organismen kommt RNA-Interferenz vor?

A
  • Pilzen („Quelling“)
  • Pflanzen („Co-Suppression“)
  • Tieren: Fruchtfliege ( Drosophila melanogaster), Nematoden (Caenorhabditis elegans), Zebrafisch, Säuger
    Einige Ausnahmen: z. B. Saccharomyces cerevisiae
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13
Q

Welcher Effakt hat RNA-Interferenz in Säugerzellen?

A
  • lange dsRNAs lösen unspezifische Immunantwort aus
  • kurze dsRNAs (18-30 Nukleotide) werden toleriert
  • führen zur transienten, aber sehr effizienten Suppression
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14
Q

Was sind die grundlegenden Schritten des RNAi-Mechanismus?

A
  1. Dicer-vermittelte dsRNA-Prozessierung
  2. Bildung des RNA-induced silencing complex (RISC)
  3. Guide-Strang-Selektion
    * Passenger (sense)-Strang wird gespalten und aus RISC entfernt
  4. Target-mRNA-Erkennung & Spaltung
    * Der guide (antisense)-Strang bindet über komplementäre Basenpaarung an die Target-mRNA
    * Endonukleolytische Spaltung der mRNA durch AGO
  5. RISC-Recycling
    * Die gespaltene Target-mRNA wird aus RISC entfernt
    * RISC kann über den guide-Strang weitere Target-mRNA binden und spalten
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15
Q

Was ist die Funktion der Dicer?

A

Dicer spaltet lange dsRNA in kurze siRNA (20–25 nt) (small interfering RNA)

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16
Q

Wie entsteht RISC (RNA-induced silencing complex)?

A

Übergabe der siRNA mit Hilfe von Dicer (+ dsRNA-bindendes Protein (dsRBP)) an Argonauten-Protein (AGO)

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17
Q

Wlecher Strang wird bei der Guide-Strang-Selektion während der RNA-Interferenz gespalten?

A

Passenger (sense)-Strang wird gespalten und aus RISC entfernt

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18
Q

Wie groß ist der Dicer? Welche Domäne hat er? Wie ist seine Tertiärstruktur?

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A
  • ca. 200 kDa
  • Multidomänenprotein
  • L-förmige Tertiärstruktur
  • Helicase clamp: „catch and feed motion“ - Förderlich für die Prozessivität
  • Helicase – DUF – Platform – PAZ – Ruler - RNase IIIa – RNase IIIb – dsRBD
19
Q

Welcher Typ von Enzym ist der Dicer? Was ist seine Funktion?

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A
  • Endoribonuklease aus der RNase III Familie
  • Spaltung langer dsRNA in kurze dsRNA Fragmente von 20-25 nt Länge (= siRNA)
20
Q

Wir groß sind die Argonauten Proteine (AGO)? Welche Domäne haben sie?

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A
  • ca. 100 kDa
  • PIWI-Domäne
21
Q

Welche Funktion haben Argonauten Proteine (AGO)?

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A

katalytische Komponente von AGO: RNase H-ähnliche Faltung mit katalytischer Tetrade (AspGluAspHis)

22
Q

Was ist ein RNA-induced silencing complex (RISC)?

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A
  • großer Ribonukleoprotein Komplex
  • minimaler RISC = guide RNA und AGO
23
Q

Was sind Eigenschaften von siRNA-Molekülen?

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A
  • Monophosphat Gruppe an beiden 5‘-Enden
  • An beiden 3‘-Enden: 3‘-Hydroxylgruppe & 2 Nukleotide Überhang
  • Spaltstelle zwischen Nukleotid 10 und 11 vom 5‘-Ende der guide RNA
  • Passenger oder sense Strang
  • identisch mit mRNA
  • Spaltung durch AGO2
  • Entfernung aus RISC
  • Degradation durch andere
  • Ribonukleasen
  • Guide oder antisense Strang
  • komplementär zur mRNA
  • definiert Spaltstelle sowohl im passenger Strang als auch in der Target mRNA
24
Q

Wo ist die Spaltstelle am siRNA?

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A

Spaltstelle zwischen Nukleotid 10 und 11 vom 5‘-Ende der guide RNA

25
Was befindet sich an beiden 5‘-Enden des siRNAs?
Monophosphat Gruppe
26
Was befindet sich an beiden 3‘-Enden des siRNAs?
3‘-Hydroxylgruppe & 2 Nukleotide Überhang
27
Was sind Eigenschaften vom Passenger oder sense Strang?
* identisch mit mRNA * Spaltung durch AGO2 * Entfernung aus RISC * Degradation durch andere Ribonukleasen
28
Was sind Eigenschaften vom Guide oder antisense Strang?
* komplementär zur mRNA * definiert Spaltstelle sowohl im passenger Strang als auch in der Target mRNA
29
Wie viele von den Schlüsselproteine kommen in Caenorhabditis elegans vor?
* 27 Argonauten Proteine RDE1: Interaktion mit primären siRNAs WAGOs: Interaktion mit sekundären siRNAs * 1 Dicer
30
Wie viele von den Schlüsselproteine kommen in Arabidopsis thaliana vor?
* 10 Argonauten Proteine Slicer Aktivität in 5 AGOs * 4 Dicer (Dicer-like) DCL1 = miRNA Biogenese (PTGS) DCL2 = Produktion viraler siRNAs (PTGS) DCL3 = Heterochromatin-Stilllegung (TGS)
31
Wie viele von den Schlüsselproteine kommen in Mensch vor?
* 4 Argonauten-Proteine (PTGS) Slicer-Aktivität nur in Ago2 * 1 Dicer
32
Was sind Funktionen von RNAi?
* RNAi schützt Pflanzen, Würmer und Insekten vor Pathogenen wie Viren, Bakterien und Pilze * RNAi erhält die Stabilität des Genoms aufrecht durch silencing mobiler Elemente (Transposons) * RNAi ähnlicher Mechanismus übt transkriptionelles gene silencing aus, führt zur Modulation von Chromatin und kann vererbt werden * ein RNAi ähnlicher Mechanismus (microRNAs) reguliert die Expression vieler Gene in Säugern
33
Was sind Anwendungsbereiche von RNAi?
* RNAi stellt ein neues experimentelles Tool zur gezielten Untersuchung spezifischer Gene dar (siRNA-mediated knockdowns) * RNAi als Therapieansatz * RNAi zur Bekämpfung von Pflanzenschädlingen
34
Wie wird RNAi zur Abtötung von Pflanzenschädlingen prinzipiell angewendet?
Entwicklung von dsRNAs zu Spezies-spezifische Insektizide
35
Was wäre eine Besispiel für RNAi zur Abtötung von Pflanzenschädlingen?
Beispiel: Transgene Kartoffelpflanzen, die dsRNAs gegen essentielle Gene des Kartoffelkäfers in Chloroplasten oder im Cytoplasma bilden - Insertion des Transgens ins Chloroplasten-Genom (keine RNAi und kein Dicer  keine Degredation der dsRNAs) - Pflanzenzellen produzieren lange dsRNAs (≥ 60 nts) - Effiziente dsRNA Aufnahme durch Darmzellen * Käfer überleben: - Insertion des Transgens ins nukleäre Genom - Bildung von kleinen siRNAs durch Dicer im Cytoplasma - Ineffiziente Aufnahme der siRNA durch Darmzellen
36
Wie führt RNAi zur Abtötung von Pflanzenschädlingen?
* Käfer sterben: - Insertion des Transgens ins Chloroplasten-Genom (keine RNAi und kein Dicer -> keine Degredation der dsRNAs) - Pflanzenzellen produzieren lange dsRNAs (≥ 60 nts) - Effiziente dsRNA Aufnahme durch Darmzellen * Käfer überleben: - Insertion des Transgens ins nukleäre Genom - Bildung von kleinen siRNAs durch Dicer im Cytoplasma - Ineffiziente Aufnahme der siRNA durch Darmzellen
37
Wie wird RNAi als Abwehrmechanismus –Antivirale RNAi angewendet?
* RNA-dependent RNA-polymerase (RdRP) * Replikation von RNA anhand einer RNA-Vorlage * RISC verwendet die siRNA als Vorlage (Guide Strang ist komplementär zur viralen RNA), um virale RNAs auf sequenzspezifische Weise zu binden und abzubauen * katalytische Domäne entfernt verwandt mit DNA-abhängigen RNA Polymerasen
38
Wo kommt der Abwehrmechanismus –Antivirale RNAi vor?
existieren in C. elegans, Pflanzen und Pilzen
39
Was passiert bei der Entstehung von primären siRNAs während der Amplifikation des RNAi-Effekts?
* Dicer-Produkte mit 5‘-Monophosphatgruppe und 2 nts-3‘-Überhänge * Assoziieren mit primary AGO (RDE-1) (RDE: RNAi-defective) * Der Komplex bestehend aus siRNA-RDE-1 bindet an Target-RNA * Rekrutierung der RdRP RRF-1 (RRF1: RNA-dependent RNA polymerase Family)
40
Was passiert bei der Entstehung von sekundären siRNAs (22 nts) während der Amplifikation des RNAi-Effekts?
* De novo Synthese durch die RdRP RRF-1 * Entstehen upstream der primären siRNA * Antisense in Bezug auf Target-RNA * Tragen 5‘-Triphosphatgruppe * Primer-unabhängige Synthese * Hoher Level an sek. siRNAs * Targetieren einen größeren Sequenzbereich der Target-RNA * Assoziieren mit WAGO (WAGO: Worm-specific AGO) * Spaltung der viralen RNA
41
Was sind die drei mögliche Mechanismen von RNAi in Pflanzen?
1. Gene silencing durch exogene RNA-Trigger 2. Gene silencing endogener mRNAs durch miRNAs 3. Transcriptional gene silencing (TGS)
42
Was passiert bei Gene silencing durch exogene RNA-Trigger?
Virusabwehr, RdRP-vermittelte Amplifikation von sekundären siRNAs
43
Was passiert bei Gene silencing endogener mRNAs durch miRNAs?
Regulation der Genexpression durch Inhibition der Translation oder RNA-Degradation
44
Was passiert bei Transcriptional gene silencing (TGS)?
DNA-Methylierung und Histonmodifikation, Transkriptionshemmung

Molekularbiologie (12 decks)

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