Séances 5 et 6 : Analyse de lymphocytes par cytométrie de flux Flashcards
(32 cards)
Quel est le nom anglais pour cytométrie de flux?
FACS (fluorescence activated cell sorter)
Selon quels paramètres le FACS peut-il discriminer les cellules d’une suspension?
Taille
Forme
Nombre
Certaines composantes cellulaires
Décrire très généralement le principe du FACS.
Principe repose sur la séparation des cellules dans un fluide et sur les modulations d’un rayon laser provoquées par les cellules qui le traverse une à une
Comment un flux continu de cellules séparées les unes des autres est-il créé?
Le fluide entraîne une suspension cellulaire à travers une buse, la réduisant en de très fines gouttelettes (ainsi le flux continu de cellules séparées est créé)
Où passent les gouttelettes ensuite?
Passent à travers un rayon laser qui est dévié proportionnellement à la taille et la forme des cellules
Si un marquage a été réalisé avant l’essai, qu’est-ce qui est produit et détecté?
Fluorescence
Doit-on utiliser un seul colorant fluorescent?
Non, on peut en utiliser plusieurs si l’appareil est muni des détecteurs appropriés
Décrire rapidement comment nous allons réaliser le FACS.
Ac monoclonaux conjugués à un colorant fluorescent lient spécifiquement des Ag de surface des cellules : «Étiquetage» permet ensuite l’identification des cellules à analyser par la détection de fluorescence
Comment extrait-on les cellules de la rate et du thymus à partir des tissus homogénéisés?
Cellules extraites par tamisage
Que fait-on avec les cellules avant de les analyser pour optimiser l’analyse au cytomètre de flux?
Dénombrer les cellules et ajuster leur concentration
Comment évalue-t-on la concentration de cellules extraites du thymus?
Grâce au protocole de décompte cellulaire
Quels marquages sont nécessaires pour la calibration du cytomètre de flux?
Marquages simples : Ac anti-CD4, Ac anti-CD8 et Ac anti-B220
Si on veut attendre plus que 24h avant l’analyse des cellules passées au tamis, qu’est-il recommandé de faire?
Fixer les cellules en les incubant dans une solution de paraformaldéhyde 4% avant de les suspendre dans le tampon FB
Quelle est la méthode habituelle pour la détermination du nombre de cellules en suspension?
Décompte avec l’hématimètre
Comment fonctionne l’hématimètre?
Hématimètre rempli d’une suspension cellulaire par capillarité. Coloration avec Trypan bleu : permet de mesurer la viabilité des cellules d’une suspension (cellules mortes deviennent bleues), visualiser plus facilement toutes les cellules
Quel est le modèle d’hématimètre le plus couramment utilisé?
AO-Spencer Bright-Line avec la chambre Neubauer modifiée
Combien de chambres principales contient l’hématimètre, combien de carrés de quelle dimension possèdent les chambres et quelle est la profondeur des carrés?
2 chambres principales
9 grands carrés de 1 mm2 de surface par 0,1 mm de profondeur
Combien de ml de la suspension contient chaque grand carré?
1 * 10^-4 ml (donc nb de cellules dans un grand carré = nb de cellules dans 1 * 10^-4 ml –> si on multiplie par 10^4, ça donne le nb de cellules dans 1 ml*** tenir en compte le facteur de dilution résultant du mélange de cellules avec le colorant)
Quelle est l’équation générale qui permet de déterminer le nombre de cellules par ml avec la méthode de l’hématimètre?
Cellules / ml = Nombre de cellules comptées (16 petits carrés) * 10^4 *facteur de dilution
Entre combien et combien de cellules doit-on avoir dans notre suspension cellulaire pour que l’erreur statistique soit acceptable?
Entre 100 et 500
À combien de % correspond l’erreur théoriquement acceptable pour 100 cellules?
10%
À combien de % correspond l’erreur théoriquement acceptable pour 500 cellules?
5%
Combien de chiffres significatifs est-il justifié d’utiliser pour l’estimation de la viabilité avec un colorant comme le Trypan bleu?
2 chiffres significatifs et moins
Entre quel et quel pourcentage de viabilité peut-on espérer d’obtenir?
Entre 60 et 90%
