Sondes Flashcards
(40 cards)
Qu’est-ce qu’une sonde moléculaire ?
Quels sont ses caractéristiques
Une molécule utilisée pour détecter une autre molécule cible, souvent un fragment d’ADN ou d’ARN.
Elle doit être spécifique, marqué et simple brin.
Quel est le principe de l’utilisation des sondes moléculaires ?
Le principe repose sur la spécificité d’hybridation des acides nucléiques : la sonde s’hybride spécifiquement avec la séquence complémentaire de la cible.
Flashcard 3
Pourquoi les ADN/ARN sont utilisés comme sondes moléculaires ?
Parce qu’ils ont une très grande spécificité d’hybridation, s’hybridant de manière stable uniquement si les séquences de nucléotides sont parfaitement complémentaires.
Que sont les oligonucléotides dans le contexte des sondes moléculaires ?
Les oligonucléotides sont de courtes séquences de nucléotides qui constituent des sondes idéales en raison de leur capacité à s’hybrider spécifiquement avec une séquence cible.
Comment une sonde moléculaire est-elle utilisée pour détecter une séquence cible ?
La sonde, qui est un fragment d’acide nucléique simple brin marqué, s’hybride avec la séquence cible complémentaire. Le marquage permet de localiser la sonde et la séquence cible dans un échantillon.
Pourquoi faut-il dénaturer l’ADN double brin avant l’hybridation ?
L’ADN double brin doit être dénaturé pour le transformer en simple brin, ce qui est nécessaire pour que l’hybridation avec la sonde se fasse correctement.
Quels paramètres expérimentaux influencent la spécificité d’hybridation ?
La température et la composition du milieu sont des facteurs clés qui influencent la spécificité d’hybridation. La température doit être juste en dessous de la Tm (température de fusion).
Qu’est-ce que la “stringence” dans le contexte de l’hybridation ?
La stringence désigne les conditions expérimentales (comme la température et la composition du milieu) qui garantissent que l’hybridation se fait de manière spécifique, permettant une détection précise.
Quelles étapes doivent être réalisées après l’hybridation pour garantir des résultats fiables ?
Après l’hybridation, des lavages post-hybridation sont nécessaires pour éliminer les sondes non fixées ou celles qui se seraient liées à des sites non spécifiques sur la membrane.
Quelles sont les deux types de marquage pour les sondes moléculaires ?
- Sondes radioactives : Marquage avec des isotopes radioactifs pour une détection par radiographie.
- Sondes froides : Marquage avec un épitope (haptene) reconnu par un anticorps spécifique, ou couplé à une enzyme ou un fluorophore pour la détection par coloration ou fluorescence sous UV.
Quel est l’avantage des sondes radioactives par rapport aux sondes froides ?
Les sondes radioactives offrent une précision de localisation supérieure, mais elles nécessitent des équipements spécifiques pour la détection de la radioactivité.
Qu’est-ce que la méthode de nick translation pour le marquage des sondes ?
La méthode de nick translation implique la coupure de l’ADN par DNase suivie de l’ajout de nucléotides marqués par l’ADN polymérase I, qui remplace les nucléotides de l’ADN dans la zone de coupure par ceux présents dans le milieu d’incubation.
Qu’est-ce que la technique FISH ?
La technique FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) utilise des fluorochromes, observés sous microscope à fluorescence, pour localiser des sondes moléculaires dans des échantillons.
Quelle est la différence entre l’hybridation in-situ et l’hybridation sur membrane ?
L’hybridation in-situ (HIS ou ISH) se fait sur des coupes de tissus pour une localisation cellulaire précise, tandis que l’hybridation sur membrane utilise des broyats de cellules ou tissus, sans localisation cellulaire précise.
Technique Southern (but, principe et liste des étapes (7))
Repérer l’ADN cible après électrophorèse.
Hybridation sur membrane avec une sonde après trajet d’ADN par capillarité.
Enzyme/ transfert/ denaturation/ électrophorèse/ hybridation/ révélation
Les 4 techniques de marquage d’ADN et comment ça marche
Nick translation (grâce aux DNAse qui couperont des liaisons puis remplacés grâce a l’ADN polymérase avec des sondes radioactive )
Random priming “amorçage au hasard” (denaturé a 100°C puis grâce aux ADN polymérase avec sondes radioactives)
Marquage des extrémités de l’ADN
Marquage d’un ADNc (rétrotranscription)
Résultats revelation
1 bande: le site de restriction de l’enzyme n’est pas situé ds la séquence
1 bandes: le fragment d’ADN cible recherche est situé à cheval sur 2 fragments
Définition carte de restriction et principe
Représentation d’un ADN et de la position des différentes sites de restriction pour une ou plusieurs enzymes
Digestion et migration
Digestion partielle et complète
Complete: raccourcir le temps d’action
Partiel: baisser la Cc des Edr
Rôle du PBS
Maintenir le pH du milieu stable
Pourquoi chauffer l’EDTA
C’est pr arriver a la température optimale d’activité des enzymes pour obtenir une dissociation plus rapide
Rôle du Bleu de Trypan
De différencier les cellules vivantes et mortes
Définition méristème
C’est un tissu végétal où les cellules enchaînent des mitoses (zone de croissance)
Définition confluence
Tapis de cellule
