T4-Isolamento do DNA plasmídico Flashcards
Elabore a curva de calibração com o DNA padrão e de seguida determine o tamanho dos
plasmídeos.
A partir da imagem da análise eletroforética fornecida, localizar as bandas resultantes
da migração. A partir dessas bandas devemos medir a distância desde o topo do gel até à banda.
Com esses valores, contruímos o gráfico, com os valores da primeira coluna, sendo que o eixo do X coloca-se a distância medida (mm) e no eixo do Y o tamanho em par de bases (pb). Após isso, faz-se a ligação dos pontos.
Para calcular o tamanho dos plasmídeos, através da reta elaborada anteriormente,
vamos ver a quantos pb corresponde cada valor de migração das outras colunas.
Para que serve o Ficol?
O ficol serve para conferir densidade à amostra auxiliando a migração no gel de
eletroforese.
Para que serve o Azul de Bromofenol?
O Azul de Bromofenol é um corante que se liga à amostra e permite ver a migração dos
fragmentos de DNA e das proteínas na “corrida”.
O que é o SDS e qual a sua função?
O SDS é um detergente aniónico. Tem como função solubilizar as proteínas e a
membrana, conferir carga negativa a todos os fragmentos e proteínas que estão a sofrer
eletroforese e romper as membranas das células (detergentes).
Qual a solução de neutralização utilizada e qual a sua função?
A solução de neutralização utilizada é o Acetato de Potássio. Esta tem a função de impedir que duas cadeias de DNA se voltem a unir quando estão separadas.
Qual a função do Brometo de Etídio?
O Brometo de Etídio é um composto que vai interagir com o DNA, intercalando-se nas
bases e permitindo a visualização através de luz UV, uma vez que este comporto emite fluorescência quando exposto a esta luz.
O que contém o tampão da amostra?
1x TAE, 10% Ficol, 0,2% SDS e 0,025% Azul de Bromofenol.
Em que direção ocorre o movimento de DNA?
Ocorre do polo negativo para o polo positivo.
Descreve o protoloco do isolamento de DNA plasmídico.
De modo a isolarmos DNA plasmidico, as células vão ter de sofrer lise celular através da
adição de SDS e NaOH (solução lise). Depois, adiciona-se solução de neutralização que serve
para neutralizar e impede a ligação entre as 2 cadeias de DNA.
Adiciona-se etanol que precipita o DNA plasmídico e etanol 70% que faz a lavagem do DNA.
Posteriormente, centrifugamos, rejeitamos o sobrenadante e adiciona-se EDTA ou tampão TE ou ainda H2O.
Dê exemplos de detergentes não iónico utilizado na lise.
EDTA e Triton-X
Dê exemplos de solventes orgânicos.
Clorofórmio, álcoois e éter.
O que são isosquisómeros?
Isosquisómeros são enzimas de restrição de diferentes espécies que reconhecem a mesma sequência numa sequência particular de DNA e cortam-na no mesmo local ou em locais diferentes, sendo este corte perfeito ou imperfeito.
No isolamento de DNA plasmídeo, para que serve o etanol absoluto seguido de incubação a -20 ºC e de centrifugação?
Promove a precipitação dos ácidos nucleicos.
O que entende por enzimas de restrição? Onde atuam? Qual o nome das extremidades às quais dão origem.
Enzimas de restrição são endonucleases específicas que cortam o DNA em locais com
sequências de nucleótidos particulares/específicas.
Atuam em sequências alvo, designadas por palíndromas.
Podem originar 2 tipos de extremidades depois do corte:
* Extremidades cegas ou abruptas
* Extremidades coesivas
Qual a concentração de agarose que se deve utilizar para um DNA com fragmentos entre
os 2500 - 2000 pb e entre 500 - 2500 pb.
5000 - 2500: 1,2% agarose
2500 - 500: 2,0% agarose
