Technique de séparation de molécules

Question 1

Que nécessite la majorité des projets en recherche pour les analyser

Answer 1

-extraction
-enrichissement
-purification

Question 2

Que sont les paramètre de purification

Answer 2

-taille
-solubilité
-charge
-densité
-marqueur ajouté ou ‘tag’

Question 3

Quel est la première étape de la purification pour libérer leur contenu

Answer 3

tampon de lyse (extraction)

Question 4

selon quel critères il faut adapter les techniques d’extraction

Answer 4

-type de matériel
-cellules animal, levure bactéries?
-volume à extraire
-nature de ce qu’on veut purifier
-souvent combinaison de traitement mécanismes chimiques et enzymatiques

Question 5

que veut-on faire dans la méthode d’extraction dans le cas des cellules

Answer 5

retirer le milieu de croissance et resuspendre dans le tampon de lyse

Question 6

que doit-on faire pour les cellules en suspension

Answer 6

les passer à la centrifugeuse à basse vitesse

Question 7

Que doit-on faire pour les cellules adhérentes

Answer 7

une trypsinisation suivie d’une centrifugation. parfois utilisation d’une enzyme protéase pour décoler les cellules du plastique

Question 8

Quelles sont les méthodes d’extraction mécaniques

Answer 8

-mortier et pillon
-mélangeur (waring blender)
-homogénéisateur de type rotor-stator
-homogénéisateur de type Dounce et Potter-Elvehjem
-homogénéisateur à billes (bead beater)
-homogénéisateur à haute pression
-sonification

Question 9

avantages/inconvénient de mortier-pillon

Answer 9

avantage:
-très efficaces pour les tissus rigides
-préserve les biomolécules
-peu couteux
désavantage:
-méthode lente et manuelle
-nécessite de l’azote liquide
-peu adapté au grands volumes

Question 10

avantages/inconvénient du blender mécanique

Answer 10

avantage:
-convenient pour grand volume
-rapide pour homogénéiser des tissus durs précoupés
-peu couteux
désavantage:
-génère beaucoup de chaleur
-moins précis pour libérer le contenus cellulaires
-non adaptés au petits volumes

Question 11

avantages/inconvénient de l’homogénéisateur de type motor-stator

Answer 11

avantage:
-rapide et efficace pour homogénéiser des tissus mous
-adapté aux grands volumes
-possibilité de préserver les organites cellulaires
désavantages:
-moins efficace pour les tissus rigides
-génère de la chaleur nécessitant un refroidissement

Question 12

avantages/inconvénient de l’homogénéisateurs de type Dounce et Potter-Elvehjem

Answer 12

avantage:
-préserve les organites cellulaires (noyaux, mitochondrie)
-méthode douce pour lyse partielle
Désavantages
-moins efficace pour les cellules robustes (bactéries, levures)
-inefficace pour les tissus rigides

Question 13

avantages/inconvénient homogénéisateur à billes

Answer 13

avantages:
-très efficaces pour les parois épaisses
-homogène pour petits volumes
désavantages:
-génère de la chaleur
-inefficace pour des grands morceaux de tissu

Question 14

avantages/inconvénient homogénéisateur haute pression

Answer 14

avantages:
-très efficace pour lyser les bactéries et levures robustes
désavantages:
-inefficace pour tissus rigides (cartilage,os)
-limité aux suspensions liquides
-volumes traités souvent restreints

Question 15

avantages/inconvénient ultrasonique (sonification)

Answer 15

avantage:
-efficace pour les bactéries et les cellules individuelles
-facile à utiliser pour suspensions
désavantages:
-génère de la chaleur (glace)
-peut fragmenter l’ADN ou dénaturer les protéines sensibles

Question 16

Quelles sont les méthodes d’extraction enzymatiques

Answer 16

-traitement enzymatique pour briser la MEC des tissus
-traitements enzymatiques pour fragiliser les parois

Question 17

Qu’est-ce que le traitements enzymatiques pour briser la MEC des tissus

Answer 17

-pratique pour isoler cellule intact
-nécessite un pré-traitement dans un tampon adapté

Question 18

Qu’est-ce que les traitements enzymatiques pour fragiliser les parois

Answer 18

-possible d’utiliser des enzymes pour dégrader la paroi
-prétraitement dans un tampon adapté
-souvent en combinaison avec lyse douce (détergents mom-ioniques, sonification…)

Question 19

Quelles sont les méthodes d’extraction chimiques

Answer 19

-détergents non ionique
-agents osmotiques
-enzyme pour dégrader la paroi
-détergents ioniques
-agents chaotropiques

Question 20

2 exemples de détergents

Answer 20

-SDS : détergent ionique fort dénaturant
fort pouvoir moussant

-Triton X-100 : Détergent non-ionique, moins irritant que le SDS

Question 21

Que font les agents chaotropiques

Answer 21

Ils brisent presque tout. Ils dénaturent les protéines et sont corrosif. Ils sont très pratique pour extraire des protéines insolubles, dénaturation des acides nucléiques (protéine membranaire)

Question 22

à quoi sert le mélange phénol-chloroforme

Answer 22

-extraire les acides nucléiques.
-Le phénol dénature les protéines et le chloroforme dissout les membranes
-Souvent en combinaison avec détergents ou agents chaotropique pour aider à la lyse

Question 23

Est-ce que les détergents non ionique sont dénaturant

Answer 23

non

Question 24

Est-ce que les agents osmotiques sont dénaturant

Answer 24

non (parfois)

Question 25

Est-ce que les enzymes pour dégrader la paroi sont dénaturant

Answer 25

non

Question 26

Est-ce que les détergents ionique sont dénaturant

Answer 26

oui

Question 27

Est-ce que les agents chaotropique sont dénaturant

Answer 27

oui

Question 28

Description des détergents non ioniques

Answer 28

perturbent doucement les membranes lipidiques sans dénaturer les protéines

Question 29

agents osmotiques description

Answer 29

Provoquent une entrée ou une sortie d'eau dans les cellules, entrainant leur éclatement ou fragilisation

Question 30

enzymes pour dégrader la paroi description

Answer 30

dégradent spécifiquement la paroi cellulaire

Question 31

détergents ioniques description

Answer 31

détruit les membranes lipidiques et dénature les protéines

Question 32

agents chaotropiques description

Answer 32

déstabilisent les interactions hydrophobe et hydrogènes , dénaturent protéines et acides nucléiques, dissocient les membranes

Question 33

S'il faut préserver la conformation/activité/structure des molécules :

Answer 33

-lyse en milieu physiologique avec système tampon -lyse douce + précaution à prendre -travailler sur glace -réactif qui ne contienne pas d'ARNase -Utilisateur d'inhibiteur de protéases -Ajout d'agents réducteurs

Question 34

Exemple d'inhibiteur de protéases

Answer 34

-PMSF -EDTA -EGTA -etc...

Question 35

La diversité de techniques de purification

Answer 35

-dialyse -filtration -centrifugation -précipitation -chromatographie -etc...

Question 36

dialyse défénition

Answer 36

-2 compartiments séparés par une membrane semi-perméable -Diffusion de solutés grâce à un gradient de concentration (atteinte de l'équilibre)

Question 37

Que sont les utilisations de la dialyse

Answer 37

-dessalage -retrait des contaminants -concentrations des protéines -modifications du pH

Question 38

Que passe à travers les membranes

Answer 38

les petites molécules (ions) les grosses molécules ne passent pas

Question 39

Qu'est-ce que la filtration

Answer 39

Utilisation de filtres avec une porosité de grande taille avec basse pression, principalement utilisé pour retirer des débris cellulaires, des bactéries et des résidus solides

Question 40

Quand la filtration est-elle effectuée

Answer 40

après l'extraction et avant la purification

Question 41

Qu'est-ce que l'ultrafiltration

Answer 41

l'utilisation de filtres avec une porosité de petite taille avec une haute pression, principalement utiliser pour concentrer les macromolécules et éliminer les petites molécules. Plus adaptée aux petits volumes